半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物制造技术

将目标抗体的重链235位丝氨酸(S)改造为半胱氨酸(C)，并通过此改造后的半胱氨酸的游离巯基(‑SH)与偶联了小分子高活性细胞毒素(Payload)的mc‑vc‑PAB‑OH连接子进行定点偶联，形成均一性优良的半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物，其毒素比抗体比例(DAR)为1.6‑2.0，此抗体‑毒素偶联物具有通式：2C2‑HC‑S235C‑mc‑vc‑PAB‑payload，同时，本发明专利技术还披露了此TDC药物的制备、纯化方法，在表达EGFRvIII及过表达EGFRwt的肿瘤的治疗应用。

【技术实现步骤摘要】
半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物
本专利技术涉及一种化合物及其制备方法和用途，特别涉及一类半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)及其制备方法和用途。
技术介绍
表皮生长因子受体EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor)是一种糖蛋白，属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。EGFR是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，贯通细胞膜，分子量170KDa，靠与配体结合来激活。激活后，EGFR由单体转化为二聚体。EGFR还可能和ErbB受体家族的其他成员聚合来激活，例如ErbB2/Her2/neu。EGFR通常低量表达于多种正常组织细胞，包括皮肤、肝脏等，与正常生理作用相关。EGFR过表达与多种肿瘤的发生与发展相关，包括头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、脑胶质瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌(Atalayetal.,2003；HerbstandShin,2002)。多种肿瘤在过量表达野生型EGFR(EGFRwt)的同时也表达突变型的EGFR，EGRFvIII(de2-7EGFR)。EGRFvIII是EGFRwt第6-273氨基酸缺失的EGFR突变型(Sugawaetal.,1990)，介导配体非依赖型的细胞持续活化。EGRFvIII被报道于多种肿瘤中，包括脑胶质瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌(Wikstrandetal.,1997；OlapadeOlaopaetal.,2000)。EGRFvIII的出现往往预示肿瘤预后不良。EGRFvIII特异性表达于肿瘤细胞组织中，正常组织细胞不表达EGRFvIII，这为靶向治疗提供了良好的靶点。抗体-毒素偶联物(Antibodydrugconjugate,ADC)是靶向治疗的热点领域，已在美国获批上市的两个药物Adcetris和Kadcyla表现出良好的临床疗效，并且有超过50个ADC药物在进行临床阶段研究。以EGFRvIII为靶点的通过链间二硫键巯基非定点偶联的ADC药物ABT-414已在美国进行临床II期试验，体现出一定的临床效果，但由于其采用非定点偶联方式，其药物均一性差，对病人造成较严重的毒副作用，限制了其临床用药量，直接影响了其临床治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的化合物半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)具有通式：2C2-HC-S235C-mc-vc-PAB-payload。其中2C2是亲本抗体2A1重链235位丝氨酸(S)改造为半胱氨酸(C)后的抗体。2C2的轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:2，2C2的重链氨基酸序列为SEQIDNO:12。2C2的亲本抗体2A1轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:2，2A1的重链氨基酸序列为SEQIDNO:14。2C2保持了其亲本抗体2A1与抗原结合的能力(亲和力)，抗原为人的野生型表皮生长因子受体(EGFRwt)及人的突变型表皮生长因子受体(de2-7EGFR/EGRFvIII)。2C2通过其重链235位改造的半胱氨酸巯基与mc-vc-PAB-payload进行抗体-毒素偶联物(TDC)定点偶联，毒素比抗体比例DAR为1.6-2.0。本专利技术的化合物半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)药物主要用于治疗表达EGFRvIII及过表达EGFRwt的肿瘤，包括脑胶质癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结直肠癌、膀胱癌、结直肠癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等。附图说明图1为实施例25实验结果图；图2-7、17、18为实施例28实验结果图；图8-9为实施例29实验结果图；图10为实施例30实验结果图；图11-14为实施例26实验结果图；图15-16为实施例27实验结果图。具体实施方式实施例1mc的合成于30ml冰醋酸中加入6-氨基己酸3.9g(0.03mol)和1.2eq的马来酸酐3.5g(0.036mol)。反应液于120℃搅拌反应4～6h。反应完毕后，停止加热，自然冷却到室温。60℃减压浓缩除去大部分醋酸。所得棕黄色粘稠液倒入水中，再加入乙酸乙酯20ml×3萃取，合并有机层。有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到棕黄色油状物，加入50ml水搅拌，有类白色固体析出，过滤，50℃减压干燥的目标产品5.08g，收率80％。mp：89-92℃。m/z：212.2[M+H]+。1HNMR(400Mz,DMSO)：13.21(br,1H,COOH)、6.75(s,2H,COCH＝CHCO)、3.63(t,2H,J＝7.2Hz,NCH2CH2)、2.42(t,2H,J＝7.4Hz,CH2COOH)、1.52-1.68(m,4H,NCH2CH2CH2CH2)、1.30-1.42(m,2H,NCH2CH2CH2CH2)。实施例2Mc-OSu的合成在氮气保护下于50ml乙腈中加入4.7g(22mmol)MC和25g(22mmol)HOSu。另取4.5g(22mmol)DCC溶于25ml乙腈中，保持内温在0℃左右，将其缓慢滴入反应液中。反应液于0℃反应2小时后再室温反应过夜。过滤，滤饼用乙腈10ml×3洗涤，滤液减压浓缩至干。所得油状物于室温减压干燥6h得到浅棕色固体6.4g，收率95％。(不纯化直接投下一步反应)m/z：309.2[M+H]+。1HNMR(400Mz,CDCl3)：1～2(m,6H,CCH2CH2CH2C)、2.68(t,2H,CH2CO)，2.95(s,4H,COCH2CH2CO)、3.68(t,2H,CH2N)、6.81(s,2H,CH＝CH)。实施例3Fmoc-Val-OSu的合成于100mlTHF中加入Fmoc-Val10g和HOSu3.4g。另取DCC6g溶于50ml乙腈中，保持内温在0℃左右，将其缓慢滴入反应液中。反应液于室温搅拌反应24小时。过滤，滤饼用THF洗涤，滤液减压浓缩得到透明油状物。油状物未经纯化直接投下一步反应。m/z：437.4[M+H]+。实施例4Fmoc-vc的合成于20mlTHF中加入Cit4.0g(1.05eq)和碳酸氢钠的水溶液60ml(NaHCO32g,1.05eq)。另取22.35mmolFmoc-Val-OSu溶于60mlDME中，再将其加入反应液中。反应液于室温下搅拌反应24小时。反应完毕后，向体系中加入15％柠檬酸水溶液110ml，然后再用EA萃取两次，合并有机层，减压浓缩得到白色固体。并向白色固体中加入甲基叔丁基醚100ml搅洗，过滤，滤饼于40℃减压干燥4h得产品4.83g，收率65％。m/z：497.6(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.92(6H,m)、1.35～1.65(4H,m)、2.10(1H,m)、3.01(2H,q)、3.99(1H,t)、4.01-4.45(2H,m)、4.45(2H,t)、5.46(2H,br)、6.03(1H,t)、7.20-8.02(8H,m)、8.25(1H,d)。实施例5Fmoc-vc-PABOH的合成于反应瓶中加入DCM/MeOH＝2/1混合溶剂60ml，再加入Fmoc-vc2g(4.2mmol)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物(TDC)具有通式：2C2‑HC‑S235C‑mc‑vc‑PAB‑payload。

【技术特征摘要】
1.半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)具有通式：2C2-HC-S235C-mc-vc-PAB-payload。2.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其中2C2是目标抗体重链235位丝氨酸(S)改造为半胱氨酸(C)后的抗体；2C2轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:2，重链氨基酸序列为SEQIDNO:12。3.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，包含一个成熟的轻链可变区，其氨基酸序列至少有90％与SEQIDNO:2相同。4.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，包含一个成熟的重链，其氨基酸序列至少有90％与SEQIDNO:12相同。5.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其中mc-vc-PAB-OH连接子为：6.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其中Payload为小分子高活性细胞毒素，包括但不限于MMAE、MMAF、PBD、SN-38及Dox；MMAE、MMAF、PBD、SN-38及Dox分子式为：7.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其中毒素比抗体比例(DAR)为1.6-2.0。8.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱义，王一茜，卓识，李杰，陈澜，余永国，万威李，
申请(专利权)人：四川百利药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川,51