一种检测铜离子的免疫荧光层析试纸条及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种检测铜离子的免疫荧光层析试纸条及其在检测样品铜离子浓度中的应用，属于铜离子检测技术领域；所述免疫荧光层析试纸条包括依次搭接的玻璃纤维垫、硝酸纤维膜和吸水纸；所述玻璃纤维垫上喷涂有铜离子单克隆抗体‑荧光微球复合物；所述硝酸纤维素膜依次设置包被铜离子检测完全抗原的检测线和包被二抗的质控线；所述免疫荧光层析试纸条使用方便，灵敏度高；检测灵敏度(IC50)为3.6ng/ml，检测范围(IC20‑IC80)为0.4‑32.3ng/ml，检测限(IC10)为0.2ng/ml。

An immunofluorescence chromatography strip for the detection of copper ions and its application

The invention provides an immunofluorescence chromatographic strip for detecting copper ion and its application in detecting copper ion concentration of a sample, belonging to the technical field of copper ion detection. The nitrocellulose membrane is successively provided with a detection line coated with copper ion for detecting complete antigen and a quality control line coated with second antibody; the immunofluorescence chromatographic strip is convenient to use and has high sensitivity; the detection sensitivity (IC50) is 3.6 ng/ml, and the detection range (IC20 IC80) is 0.4 32.3 ng/ml. The detection limit (IC10) is 0.2ng/ml.

【技术实现步骤摘要】
一种检测铜离子的免疫荧光层析试纸条及其应用
本专利技术属于重金属免疫检测
，尤其涉及一种检测铜离子的免疫荧光层析试纸条及其应用。
技术介绍
重金属在地球上广泛分布，正常情况下不会对人类的生活环境造成危害。但随着城市的急速扩张和工业的快速发展，大量重金属因人为活动以非常态速度进入我们的生活环境，这些重金属及其化合物多有致畸、致癌作用，并且都是蓄积性毒物，通过饮用水或食物链富集等方式严重危害人类及动物的健康。目前对于环境污染最严重的重金属包括：铅、镉、汞、铬、砷(号称“五毒”)，除此之外，还包括毒性相对较弱的镍、锌、铜、钴、锡、钒等。虽然重金属铜的毒性相对较弱，但是因其在工业、农业及畜牧业的广泛应用，铜污染的危害也越来越多的引起人们的关注。人体摄入过量的铜会引发一系列病变，急性铜中毒可引起胃肠道黏膜刺激症状，如恶心、干呕、腹泻，甚至溶血性贫血，肾功能衰竭、休克、昏迷或死亡。慢性摄入铜过高，可引起呼吸系统疾病，铜粉尘可引起咽痛、咳嗽、咯痰和胸闷气憋，甚至出现尘肺等。另外，铜盐具有一定杀菌效果，所以在饲料中也被广泛使用，但高剂量的铜进入家畜的体内很难被代谢，随着生物累积效应造成家畜中毒死亡，还会通过食用家畜肉制品而直接威胁人类健康。因此，加强食品和环境卫生的重金属铜的监查检测迫在眉睫，意义重大。传统重金属检测方法多采用物理/化学方法，如原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)、电感耦合等离子体光谱分析法(ICP)等，虽然其检测结果准确，可信度高，但需要大型仪器设备和专业人员操作，分析时间长，成本昂贵，有一定时间地点局限性，难以适应突发性的环境污染事件或大规模环境质量筛查检测。现有的重金属铜的检测方法成本高、效率低、准确性欠佳。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种成本低、效率高、准确率高的检测铜离子的免疫荧光层析试纸条及其应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种检测铜离子的免疫荧光层析试纸条，包括依次搭接的玻璃纤维垫、硝酸纤维膜和吸水纸；所述玻璃纤维垫表面喷涂有铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物；所述硝酸纤维素膜依次设置包被铜离子检测完全抗原的检测线和包被二抗的质控线；所述铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物由铜离子单克隆抗体与荧光微球偶联获得；所述铜离子检测完全抗原包括铜离子、载体蛋白以及将所述铜离子与载体蛋白偶联的螯合剂。优选的，所述铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物的浓度为0.03～0.05μg/μl；所述玻璃纤维垫上铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物的喷涂量为3～5μl/cm。优选的，所述铜离子单克隆抗体由杂交瘤细胞株4F12分泌产生，所述杂交瘤细胞株4F12的保藏编号为CCTCCNO：C201670。优选的，所述铜离子检测完全抗原的喷涂浓度为0.3～0.6μg/μl；所述硝酸纤维素膜上铜离子检测完全抗原的喷涂量为0.1～0.2μl/mm。优选的，所述铜离子检测完全抗原中的螯合剂为双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA；所述载体蛋白为鸡卵白蛋白OVA。本专利技术还提供了所述免疫荧光层析试纸条在检测样品铜离子浓度中的应用。优选的，包括以下步骤：1)将待检样品滴加到玻璃纤维膜上进行层析；2)读取所述层析后的免疫荧光试纸条检测线、质控线的荧光信号值Bt和Bc；3)将所述荧光信号值Bt/Bc作为B值带入预定的标准曲线线性回归方程计算获得待检样品中铜离子浓度；所述预定的标准曲线线性回归方程的自变量为铜离子浓度的log10对数，因变量为发光抑制率，所述因变量由式I计算得到，(B0-B)/B0×100％式I，B0为未添加待检样品或未添加标准样品时的荧光信号值Bt0/Bc0，B为添加待检样品时的荧光信号值Bt/Bc。优选的，所述标准曲线线性回归方程通过以下方法获得：用梯度浓度的竞争物标准品Cu-NOTA替换步骤1)中的待检样品，按照步骤1)～2)的方法获得竞争物标准品的荧光信号值Bt/Bc，以0ng/ml竞争物标准品的荧光信号值Bt0/Bc0为B0，计算得到梯度浓度竞争物标准品的发光抑制率，以发光抑制率为纵坐标，以Cu2+浓度log10对数为横坐标，绘制标准曲线，获得标准曲线线性回归方程。优选的，步骤1)中所述待检样品的滴加量为60～90μl；所述层析时间为12～18min。优选的，所述样品包括中草药样品、土壤样品和水样。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的免疫荧光层析试纸条包括依次搭接的玻璃纤维垫、硝酸纤维膜和吸水纸；所述玻璃纤维垫上喷涂有铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物；所述硝酸纤维素膜依次设置包被铜离子检测完全抗原的检测线和包被二抗的质控线。所述铜离子检测完全抗原将小分子的铜离子与载体蛋白偶联，使铜离子能够通过免疫的方法检测，利用发光抑制率与铜离子浓度log10对数的线性关系定量测定铜离子浓度；本专利技术以发光抑制率为纵坐标，以Cu2+浓度log10对数为横坐标，绘制标准曲线，检测待检样品中铜离子的浓度，能够实现铜离子浓度的快速高效检测；所述免疫荧光层析试纸条，使用方便，灵敏度高；检测灵敏度(IC50)为3.6ng/ml，检测范围(IC20-IC80)为0.4-32.3ng/ml，检测限(IC10)为0.2ng/ml。满足GB5749《生活饮用水卫生标准》生活饮用水、GB3838《地表水环境质量标准》Ⅰ类～Ⅴ类水中铜最低限量值0.01mg/L的检测要求。附图说明图1为实施例1中的免疫荧光层析试纸条的结构图；图2为铜离子检测完全抗原的SDS-PAGE鉴定图；图3为BCA法测定铜离子检测完全抗原蛋白浓度的标准曲线；图4为实施例2中免疫荧光层析试纸条检测卡检测不同浓度竞争物标准品的结果照片；图5为实施例2中免疫荧光层析试纸条检测卡荧光信号曲线图；图6为实施例2中免疫荧光层析试纸条法测定铜离子浓度标准曲线。生物保藏说明杂交瘤细胞株4F12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学；保藏时间：2016年6月8日，保藏编号为CCTCCNO：C201670。具体实施方式本专利技术提供了一种检测铜离子的免疫荧光层析试纸条，如图1所示，包括依次搭接的玻璃纤维垫(6)、硝酸纤维膜(3)和吸水纸(2)；所述玻璃纤维垫上喷涂有铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物；所述硝酸纤维素膜依次设置包被铜离子检测完全抗原的检测线(4)和包被二抗的质控线(5)；其中箭头所指方向为层析方向；所述铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物由铜离子单克隆抗体与荧光微球偶联获得；所述铜离子检测完全抗原包括铜离子、载体蛋白以及将所述铜离子与载体蛋白偶联的螯合剂。在本专利技术中，所述玻璃纤维垫作为样品垫；所述玻璃纤维垫采用市售玻璃纤维垫即可。本专利技术所述玻璃纤维垫上喷涂铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物；所述喷涂有铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物的玻璃纤维垫通过以下步骤制备获得：将所述铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物喷涂于玻璃纤维垫上后进行干燥。在本专利技术中所述铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物的喷涂浓度为0.03～0.05μg/μl；更优选为0.04μg/μl；所述铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物的喷涂量优选为3～5μl/cm，更优选为4μl/cm。所述喷涂优选的采用喷涂仪进行；本专利技术在喷涂结束后优选的将所述喷涂有铜离子单克隆抗体-荧光微球复本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测铜离子的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，包括依次搭接的玻璃纤维垫、硝酸纤维膜和吸水纸；所述玻璃纤维垫表面喷涂有铜离子单克隆抗体‑荧光微球复合物；所述硝酸纤维素膜依次设置包被铜离子检测完全抗原的检测线和包被二抗的质控线；所述铜离子单克隆抗体‑荧光微球复合物由铜离子单克隆抗体与荧光微球偶联获得；所述铜离子检测完全抗原包括铜离子、载体蛋白以及将所述铜离子与载体蛋白偶联的螯合剂。

【技术特征摘要】
1.一种检测铜离子的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，包括依次搭接的玻璃纤维垫、硝酸纤维膜和吸水纸；所述玻璃纤维垫表面喷涂有铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物；所述硝酸纤维素膜依次设置包被铜离子检测完全抗原的检测线和包被二抗的质控线；所述铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物由铜离子单克隆抗体与荧光微球偶联获得；所述铜离子检测完全抗原包括铜离子、载体蛋白以及将所述铜离子与载体蛋白偶联的螯合剂。2.根据权利要求1所述的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，所述铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物的浓度为0.03～0.05μg/μl；所述玻璃纤维垫上铜离子单克隆抗体-荧光微球复合物的喷涂量为3～5μl/cm。3.根据权利要求1或2所述的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，所述铜离子单克隆抗体由杂交瘤细胞株4F12分泌产生，所述杂交瘤细胞株4F12的保藏编号为CCTCCNO：C201670。4.根据权利要求1所述的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，所述铜离子检测完全抗原的浓度为0.3～0.6μg/μl；所述硝酸纤维素膜上铜离子检测完全抗原的喷涂量为0.1～0.2μl/mm。5.根据权利要求1或4所述的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，所述铜离子检测完全抗原中的螯合剂为双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA；所述载体蛋白为鸡卵白蛋白OVA。6.权利要求1～5任意一项所述免...

【专利技术属性】
技术研发人员：向军俭，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44