一种基于ITS2鉴定竹节参及其非同属混伪品的方法技术

一种基于ITS2鉴定竹节参及其非同属混伪品的方法本发明专利技术公开了一种DNA水平鉴定竹节参及其非同属混伪品的方法，包括如下步骤：1)提取待测样品竹节参DNA；2)以待测样品DNA为模板，PCR扩增ITS2序列的片段；3)将PCR产物正向测序，经过ITS2 database剪切获得竹节参ITS2序列；4)构建NJ系统发育树、种内及种间平均遗传距离分析、二级结构特征比较。结果表明竹节参的ITS2序列聚类在一起，竹节参种内平均遗传距离显著小于竹节参与其非同属混伪品种间平均遗传距离、且竹节参二级结构与非同属混伪品二级结构差异大，说明ITS2序列作为快速准确鉴定竹节参及其非同属混伪品。本发明专利技术方法操作简单、分辨率高，适用性和重复性强，能够实现可快速准确鉴定竹节参及其非同属混伪品。

A method for identification of Panax japonicus and its non counterfeit products based on ITS2

A method based on ITS2 for identifying Panax japonicus and its non-homologous adulterants discloses a method for identifying Panax japonicus and its non-homologous adulterants at DNA level. The method comprises the following steps: 1) extracting the DNA of Panax japonicus from the sample to be tested; 2) amplifying the fragments of ITS2 sequence with the DNA of the sample to be tested; 3) positively sequencing the PCR products, and then sequencing them. ITS2 sequences were obtained by ITS2 database cutting; 4) NJ phylogenetic trees were constructed, average genetic distances within and between species were analyzed, and secondary structural characteristics were compared. The results showed that ITS2 sequences were clustered together, and the average genetic distances within species of Panax japonicus were significantly smaller than those among the hybrids with different genus, and the secondary structure of Panax japonicus was significantly different from that of the hybrids with different genus. This indicated that ITS2 sequences could be used to identify Panax japonicus and its hybrids quickly and accurately. . The method has the advantages of simple operation, high resolution, strong applicability and repeatability, and can quickly and accurately identify Panax japonicus and its adulterants.

【技术实现步骤摘要】
一种基于ITS2鉴定竹节参及其非同属混伪品的方法
本专利技术涉及一种基于ITS2序列快速鉴定竹节参与其非同属混伪品的方法。
技术介绍
竹节参为五加科人参属植物竹节参(PanaxjaponicusC.A.Mey.)的干燥根茎，别名北三七、竹节三七等，属于我国珍稀濒危中草药，被称作“草药之王”。竹节参性温，味甘、微苦，归肝、脾、肺经，兼具北药人参补虚强壮、南药三七活血化瘀等功效，主治病后虚弱、跌扑损伤等病症。现代药理学研究表明，皂苷类、挥发油、糖类、氨基酸等化学物质是竹节参的药用成分，其中皂苷类成分通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)和核因子kappaB(nuclearfactor-kappaB,NF-kB)信号通路发挥抗炎作用，此外皂苷类成分降低心肌缺血再灌注损伤的效应、通过Fas/FasL途径缓解皮肤过度凋亡细胞死亡引起的皮肤症状、并在人神经母细胞瘤细胞中显示出显着的神经突生长增强活性。而且，竹节参粗提取物和多糖被证明具有明显的补充血液的能力，可以防止环磷酰胺引起的造血功能下降，并抑制肿瘤生长；显然竹节参皂苷、多糖成分或粗提取物对肿瘤、慢性综合症、人体四大系统(消化、中枢神经、心血管、免疫)等均有明显的药理作用。由于竹节参在中医临床治疗、保健品、化妆品等领域的广泛应用，人们对竹节参的需求量与日俱增。然而，市场上常有八角莲、红毛七、麻布七、景天三七等非同属混伪品冒充或误当正品竹节参使用或售卖，它们有的名字相近，在民间使用中容易混淆，有的加工后形状与竹节参相似，但药材内在质量和成分却极大不同，其中八角莲曾被报道因形似竹节参而被掺杂在竹节参中作药用，因八角莲含有有毒的鬼臼毒素，病人误用八角莲后易发生消化、神经和心血管系统中毒，甚至死亡。中药市场同名异物的混淆品或代用品极多，混伪品扰乱了中药材市场的秩序，较大影响了竹节参的用药疗效及安全。为保障中药材质量，确保临床用药安全有效，急需寻求一种精准可靠、高效稳定的方法应用于鉴别区分竹节参及其非同属混伪品。目前，传统的中药材鉴定主要通过鉴别药材的颜色、形态、气味、切片等来鉴定药材的真伪与纯度，常见有基于形态性状特点的基源、性状、显微及理化鉴定等。朱永红等曾通过性状鉴别竹节参及混伪品麻布七、金边七、红毛七等，朱应辉等曾从性状和显微特征角度鉴别区分竹节参与伪品八角莲，夏黎等亦曾结合性状和显微鉴别竹节参及景天三七；四大传统中药鉴定方法(基源、性状、显微及理化鉴定)历经多年沉淀积累，解决了不少中草药第一线质量把关的问题，但要求鉴定员必须具有丰富而扎实的分类学知识和鉴别经验，由于受鉴定人员经验、药材生长和采摘环境的影响,其鉴定结果常常缺乏准确性和可重复性。随着分子遗传标记技术在药用植物学研究领域的渗透及应用，越来越多的植物类药材开始尝试分子水平的遗传分析鉴定，DNA条形码是指利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段作为物种标记而建立的一种新的生物分子鉴定方法，加拿大分类学家PaulHebert于2003年首次提出。该方法通过筛选确定通用条形码，确立条形码数据库和鉴定平台，通过生物信息学分析方法分析比对DNA数据，而对物种进行鉴定。DNA条形码鉴定快速准确、有望实现自动鉴定，传统生物鉴定方法的有效补充，而受到了国内外学者的广泛关注，目前已成为物种鉴定和分类的研究热点。与其他分子鉴定方法相比，DNA条形码鉴定具有三大优势:鉴定结果可重复性良好;方法通用性强;可构建统一数据库和鉴定平台，易于推广和标准化。目前,DNA条形码技术得到了大多数专家学者的认可,在物种鉴定中得到了广泛而有效的应用,可快速、准确地鉴别植物种类;该技术在中药材鉴定中得到了广泛的应用和快速发展,在药用植物及植物源药材鉴定等方面均取得了突出成绩,加快了中药鉴定标准化的进程。不同DNA条形码具有各自优点和缺点，例如matK难以进行扩增和测序,引物通用性差,不同植物类群通常需要使用不同的引物；rbcL序列虽然具有通用、易扩增、易比对的优点,但是在物种水平上的变异性不显著；psbA-trnH比较容易设计通用引物,并且具有高通用性、扩增成功率高的特点,但是该片段在不同物种间间隔区的长度或拷贝的变异性较大,存在过多的插入/缺失现象,较难在大规模的样本间进行序列比对,导致鉴别同属的植物物种较困难；ITS具有较好的稳定性与准确性,但是在对一些物种的鉴定中,ITS并不能获得有效的鉴定结果。陈士林等将7种DNA条形码片段(psbA-trnH,matK,rbcL,rpoC1,ycf5,ITS2,andITS)应用于鉴别来自753个属4800种超过6600份植物样品，比较结果发现ITS2在植物鉴定中的鉴定分辨率高达92.7%，并提出ITS2可作为鉴定植物类群的识别条形码。罗焜等将目前热点候选序列(matK,rbcL,psbA-trnH,rpoC1,ycf5)及nrDNA-ITS序列与芸香科72属192种300个样本进行比较,试图在同一科属具有较多近缘种的条件下,真实判定各序列的鉴定能力,结果表明,ITS2的PCR扩增和测序成功率较高,具有最大的种间变异和较小的种内变异,且种内种间变异存在极显著差异,各评价指标均优于其他候选序列,并且物种鉴定成功率最高。越来越多研究者利用大量的植物材料对热点候选条形码序列进行了分析研究,并提出ITS2最适合作为DNA条形码。ITS2(internaltranscribedspacer2)基因序列是去除5.8SrRNA序列和28SrRNA序列的核糖体DNA序列间隔区,具有良好的通用性,片段足够短并且易扩增、测序。ITS2序列的变异位点能够确保其鉴定能力,维持物种鉴定的成功率,从而能够鉴定种类繁多、数量庞大的中药基原植物。ITS2序列在多个科属基原植物及植物类药材中的鉴定能力已得到大量的验证,能够鉴定种类繁多、数量庞大的药用植物及其密切相关的物种，并且ITS2的变异位点也足够确保其鉴定能力,维持其鉴定物种的成功率。因此，本专利技术利用ITS2序列对竹节参及其非同属混伪品进行DNA分子鉴定，为竹节参的快速准确鉴定及用药安全提供科学依据。
技术实现思路
本专利技术的目的：为了克服竹节参的传统性状、组织显微鉴别等方法的局限性和复杂性的技术不足，提供一个利用核糖体DNA的ITS2片段鉴别竹节参及其非同属混伪品的方法。本专利技术具体包括以下步骤，如下。（1）提取待测竹节参样品DNA（植物组织DNA快速提取试剂盒法天根DP305）。（2）PCR扩增含有核糖体DNA的ITS2序列。（3）电泳琼脂糖凝胶电泳检测。（4）将PCR产物交由华大基因公司进行正向测序，经过ITS2database剪切获得竹节参ITS2序列。（5）通过GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下载竹节参及其非同属混伪品的ITS2序列集。（6）构建NJ树、种内及种间平均遗传距离分析、二级结构特征比较。（7）鉴定判断：如果竹节参的ITS2序列聚类在一起，竹节参种内平均遗传距离显著小于竹节参与其非同属混伪品种间平均遗传距离、且竹节参二级结构与非同属混伪品二级结构差异大，说明ITS2序列可作为快速准确鉴定竹节参及其非同属混伪品的方法。所述步骤（2）中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于ITS2序列快速鉴定竹节参与其非同属混伪品的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）提取待测竹节参样品DNA，PCR扩增含有核糖体DNA的ITS2序列，将 PCR 产物正向测序，经过ITS2 database剪切获得竹节参ITS2序列；（2）采用ClustalW方法进行多重序列比对，应用MEGA 6.06软件构建NJ系统发育树（Neighbor‑Joining tree），利用Bootstrap法进行1000次重复分析，检验各系统发育枝的支持率，分析各物种分支是否具有单系性；（3）应用MEGA 6.06软件基于双参数模型Kimura two‑parameter (K2P)计算种内与种间最小、最大和平均遗传距离；（4）通过ITS2 database (http://its2.bioapps.biozentrum.uni‑wuerzburg.de) 预测竹节参及其混伪品ITS2二级结构；（5）如果NJ树中竹节参的ITS2序列聚类在一起，竹节参种内平均遗传距离显著小于竹节参与其非同属混伪品的种间平均遗传距离、且竹节参二级结构与非同属混伪品二级结构差异大，说明ITS2序列可快速准确鉴定竹节参及其非同属混伪品。...

【技术特征摘要】
1.一种基于ITS2序列快速鉴定竹节参与其非同属混伪品的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）提取待测竹节参样品DNA，PCR扩增含有核糖体DNA的ITS2序列，将PCR产物正向测序，经过ITS2database剪切获得竹节参ITS2序列；（2）采用ClustalW方法进行多重序列比对，应用MEGA6.06软件构建NJ系统发育树（Neighbor-Joiningtree），利用Bootstrap法进行1000次重复分析，检验各系统发育枝的支持率，分析各物种分支是否具有单系性；（3）应用MEGA6.06软件基于双参数模型Kimuratwo-parameter(K2P)计算种内与种间最小、最大和平均遗传距离；（4）通过ITS2database(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de)预测竹节参及其混伪品ITS2二级结构；（5）如果NJ树中竹节参的ITS2序列聚类在一起，竹节参种内平均遗传距离显著小于竹节参与其非同属混伪品的种间平均遗传距离、且竹节参二级结构与非同属混伪品二级...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘镛，黄遵楠，陈镜安，杨璐，李荣钊，张家明，胡敏，林好，吕思敏，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44