本发明专利技术提供一种基于FRET的PCR均相检测系统及其应用，该PCR均相检测系，包括至少一个荧光或淬灭标记的连接标签序列的加尾引物，即可以启动DNA合成的引物；与标签序列互补的淬灭或荧光标记的寡核苷酸序列，以及反向扩增引物。本发明专利技术通过荧光定量PCR仪器可以及时观察信号，并在反应结束时立刻得到结果。
A PCR homogeneous detection system based on FRET and its application
The present invention provides a FRET-based PCR homogeneous detection system and its application. The PCR homogeneous detection system includes at least one fluorescent or quenched tag sequence tailed primer that can initiate DNA synthesis; quenched or fluorescent tagged oligonucleotide sequences complementary to the tag sequence; and reverse amplification primers. Things. The fluorescence quantitative PCR instrument can observe the signal in time and get the result immediately at the end of the reaction.
【技术实现步骤摘要】
一种基于FRET的PCR均相检测系统及其应用
本专利技术涉及基因检测领域，特别是涉及一种基于FRET的PCR均相检测系统及其应用。
技术介绍
SNP检测是目前检测需求最多的一种基因检测。SNP分型方法可谓千姿百态，但随着新技术、新方法与仪器的不断出现，有些方法已经不再使用，或者仅仅用来做辅助性验证，有些方法很高大上，但不适合大范围使用。单核苷酸多态性是指基因组上单个碱基的改变造成的DNA序列的多态性。主要是是指转换与颠换，也包括极少的插入或缺失。SNP是遗传变异中最常见的，占已知多态性的90％以上，在人类基因组中广泛存在。由于其分布广，稳定遗传的特点，许多疾病易感性或药物反应差异都与其紧密相关，所以，目前越来越多地应用到分子诊断、新药开发、个体化用药、临床检验等方面。Taqman探针法，仅靠退火温度竞争一种机制来分型，Arms探针法不能实时荧光检测。美国专利US7615620B2公开了一种PCR检测系统，其中Kasp法检测SNP位点需要7条寡核苷酸，并且主要是终点SNP分型，不适用于实时荧光SNP分型。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种基于FRET的PCR均相检测系统及其应用，用于解决现有技术中Kasp法检测SNP位点需要7条寡核苷酸，并且主要是终点SNP分型，不适用于实时荧光SNP分型等问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种基于FRET的PCR均相检测系统，包括至少一个荧光或淬灭标记的连接有标签序列的加尾引物，即可以启动DNA合成的引物；与所述标签序列互补的淬灭或荧光标记的寡核苷酸序列，以及反向扩增引物。在本专利技术的一些实施例中，所述标签序列的长度为9-125bp。在本专利技术的一些实施例中，所述寡核苷酸序列长度为9-125bp。在本专利技术的一些实施例中，所述标签序列与所述寡核苷酸序列的互补方式包括正向互补、反向互补。在本专利技术的一些实施例中，荧光或淬灭基团的标记位置为所述标签序列的任意碱基位置，加尾引物上的标记基团与寡核苷酸序列上的标记基团相互靠近。在本专利技术的一些实施例中，荧光标记基团选自FAM、、TET、HEX、VIC、JOE、TAMRA、ROX、TEXAS-RED、CY3、CY5等中的至少一种。与前述基团具有类似发射波长的荧光基团均适用于本专利技术。在本专利技术的一些实施例中，淬灭标记基团选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、MGB、DABCYL、ECLIPSE等与之类似吸收波长的淬灭基团中的至少一种。与前述基团具有类似发射波长的荧光基团均适用于本专利技术。在本专利技术的一些实施例中，所述加尾引物为两个，其中一个加尾引物中含有如下标签序列：TGGACTACCATAGATGTGCTGC(SEQIDNO.6)，另一个加尾引物中含有如下标签序列：ACTTCACCGGTCTGGCGGGTTCA(SEQIDNO.7)。标签序列即为加尾序列。标签序列不限于前述两个序列，根据待检测基因的不同，也可以设计为其他标签序列。在本专利技术的一些实施例中，所述荧光标记的连接有标签序列的加尾引物包括G-F1-25、A-F1-25，所述G-F1-25的核苷酸序列如下所示：5’-FAM-TGGACTACCATAGATGTGCTGCACTATTTTCTTGACCCCTACTTACG-3’(SEQIDNO.1)；单下划线部分序列即为标签序列。所述A-F1-25的核苷酸序列如下所示：5’-HEX-ACTTCACCGGTCTGGCGGGTTCAACTATTTTCTTGACCCCTACTTACA-3’(SEQIDNO.2)；单下划线部分序列即为标签序列。所述淬灭标记的连接标签序列的加尾引物序列包括淬灭F、淬灭H，所述淬灭F的核苷酸序列如下所示：5’-GCAGCACATCTATGGTAGTCCA-BHQ1-3’(SEQIDNO.3)；所述淬灭H的核苷酸序列如下所示：5’-TGAACCCGCCAGACCGGTGAAGT-BHQ1-3’(SEQIDNO.4)；所述反向扩增引物的核苷酸序列如下所示：TAGTAGACAACATACGACCAC(SEQIDNO.5)。本专利技术第二方面提供上述PCR均相检测系统在单核苷酸多态性检测中的应用。PCR过程在多次循环之后实时监测，本专利技术可以用于实时荧光PCR中特异靶序列的扩增检测。适用的实时荧光PCR仪器包括但不限于：AppliedBiosystems(ABI)公司的7300、7500、7700，Roche公司的LightCycler2.0、LightCycler480，西安天隆公司的TL998A等等。PCR检测过程仅通过使用PCR退火杂交后进行监测。本专利技术不限于等位基因特异性PCR、SNP分型、基因缺失和病原体检测。PCR检测过程仅通过使用PCR退火杂交后进行监测。如上所述，本专利技术的一种基于FRET的PCR均相检测系统及其应用，具有以下有益效果：本专利技术在ARMS-PCR两条引物的5'末端分别连接一条与模板不匹配的荧光尾巴，并分别合成一条与之对应的反向互补引物序列。所设计的荧光标签序列与被检测基因不同源或不完全同源。该尾巴5'端进行荧光基团单标(FAM或HEX，不限于这两种)，与之互补的序列3'端用淬灭基团标记(BHQ1或者BHQ2等，不限于这两种)，所设计的的两个标签序列解链温度(Tm值)、GC含量相近，确保在相同温度下解链状态相近。这两条加尾的荧光引物的3'端碱基分别与野生型、突变型的等位基因相结合。如果扩增引物3’端碱基完全匹配，荧光引物就会顺利延伸成为模板，淬灭尾巴会解离并释放对应荧光；若扩增引物3’端碱基形成错配，延伸就会受阻滞，荧光引物依然与淬灭引物结合，没有相应荧光释放。通过荧光定量PCR仪器可以及时观察信号，并在反应结束时立刻得到结果。附图说明图1a-1e显示为本专利技术的单引物扩增原理示意图。图2a-2e显示为本专利技术的SNP基因分型检测原理示意图。图3显示为本专利技术实施例中带有rs662-A目的片段的质粒图谱。图4显示为本专利技术实施例中带有rs662-G目的片段的质粒图谱。图5显示为本专利技术实施例1中单组荧光引物扩增曲线图。图6显示为本专利技术实施例2中质粒GG的双荧光引物组扩增曲线图。图7显示为本专利技术实施例2中质粒AA的双荧光引物组扩增曲线图。图8显示为本专利技术实施例2中质粒GA的双荧光引物组扩增曲线图。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。此外应理解，本专利技术中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本专利技术中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于FRET的PCR均相检测系统，包括至少一个荧光或淬灭标记的连接有标签序列的加尾引物，与标签序列互补的淬灭或荧光标记的寡核苷酸序列，以及反向扩增引物。
【技术特征摘要】
1.一种基于FRET的PCR均相检测系统，包括至少一个荧光或淬灭标记的连接有标签序列的加尾引物，与标签序列互补的淬灭或荧光标记的寡核苷酸序列，以及反向扩增引物。2.根据权利要求1所述的PCR均相检测系统，其特征在于：所述标签序列的长度为9-125bp。3.根据权利要求1所述的PCR均相检测系统，其特征在于：所述标签序列与所述寡核苷酸序列的互补方式包括正向互补、反向互补。4.根据权利要求1所述的PCR均相检测系统，其特征在于：荧光标记基团选自FAM、TET、HEX、VIC、JOE、TAMRA、ROX、TEXAS-RED、CY3、CY5中的至少一种；淬灭标记基团选自BHQ0、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、MGB、DABCYL、ECLIPSE中的至少一种。5.根据权利要求1所述的PCR均相检测系统，其特征在于：荧光或淬灭基团的标记位置为所述标签序列的任意碱基位置，加尾引物上的标记基团与所述寡核苷酸序列上的标记基团相互靠近。6.根据权利要求1所述的PCR均相检测系统，其特征在于，所述加尾引物为两个，其中一个加尾引物中含有如下标签序列：TGGACTACCATAGATGTGCTGC(SEQIDNO.6)，另一个加尾引物中含有如下标签序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：王卫东，钟京，毛赟赟，李京励，
申请(专利权)人：王卫东，
类型：发明
国别省市：山东,37
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