一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用，该试剂盒由反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品和阴性对照品冻干管组成。荧光定量PCR反应液冻干管由Taq酶、反转录酶、检测用引物、探针和dNTPs混合冻干而成。本发明专利技术试剂盒检测时间短(反应时间仅42分钟)、特异性强、灵敏度高、便于储存(4℃保存)，配合恒温隔绝式PCR仪使用，非常适合对基因C型鸭甲肝病毒的现场快速检测，可以在基层广泛推广。

A C duck hepatitis A virus detection kit based on isothermal isolation fluorescent PCR platform and its application

The invention discloses a genotype C duck hepatitis A virus detection kit based on a constant temperature isolation fluorescent PCR platform and its application. The kit consists of a reaction buffer, a fluorescent quantitative PCR reaction liquid lyophilized tube, a positive reference and a negative reference lyophilized tube. The lyophilized tube of fluorescent quantitative PCR reaction fluid was composed of Taq enzyme, reverse transcriptase, detection primer, probe and dNTPs. The kit has the advantages of short detection time (reaction time is only 42 minutes), strong specificity, high sensitivity and easy storage (4 C). It is suitable for rapid detection of genotype C duck hepatitis A virus in situ and can be widely popularized in grass roots units.

【技术实现步骤摘要】
一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用。
技术介绍
基因C型鸭甲肝病毒(DuckhepatitisAvirustypeC,DHAV-C)以引起鸭的肝炎及多器官出血为特征。近年来在亚洲地区广泛流行并导致经济损失(任丽倩,李晶,毕玉海,等.鸭甲型病毒性肝炎的研究进展[J].生物T程学报,2012,28(7):789～799)。鸭病毒性肝炎1945年在美国首次被发现，DHAV最终被归为小RNA病毒科、禽肝炎病毒属、鸭甲型肝炎病毒、血清l型鸭甲型肝炎病毒(Levinep，HofstadM.Duckdiseaseinvestigation[J].AnnualReportoftheNewYorkStateVeterinaryCollege,Ithaca,1945,55～56)，之后被鉴定出三种基因型即DHAV-A、DHAV-B、DHAV-C，其中A型和C型在中国及韩国鸭场的发生的频率较高。近年我国流行病学调查结果显示，在以往防控政策的影响下，DHAV-A型病毒的流行趋势得到有效控制，而DHAV-C在我国诸多养殖场被检出(LinSL,CongRC,ZhangRH,eta1.CirculationandinvivodistributionofduckhepatitisAvirustypes1and3ininfectedducklings[J].Archivesofvirology,2015,l-12)，表明DHAV-C已日渐成为我国鸭病毒性肝炎的主要病原，因此对该病原流行病学调查和有效监测具有重要意义.能引起鸭肝炎的病原较多，包括基因A型鸭甲肝病毒，新城疫病毒，鹅细小病毒，番鸭细小病毒，禽流感病毒，禽腺病毒，鸭星状病毒1型，鸭星状病毒2型，鸭源巴氏杆菌、大肠杆菌O46、沙门氏菌、鸭疫里默氏菌等，且临床上感染引起的症状多不典型，仅凭临床症状较难区分，故早期的鉴别诊断尤为重要，病原检测可以提供感染的直接证据，是最可靠的诊断手段，PCR、荧光定量PCR是最为常用的病原学检测手段，尤其荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，已经成为动物疫病诊断的主流手段。但是普通的荧光定量PCR方法由于需要大型设备、操作复杂、反应时间长等因素制约了其在现场快速检测方面的应用。因此针对基因C型鸭甲肝病毒建立一种快速、敏感、特异、适用于现场的检测方法迫在眉睫。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用，本专利技术是基于恒温隔绝式荧光PCR的一种简单、快速、灵敏度高和特异性强的检测方法，可以为基因C型鸭甲肝病毒的现场检测提供科学依据，对保障水禽养殖业健康发展具有重要意义。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测的引物和探针，所述引物和探针包括：基因C型鸭甲肝病毒上游引物、基因C型鸭甲肝病毒下游引物和基因C型鸭甲肝病毒探针，其中，所述基因C型鸭甲肝病毒上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述基因C型鸭甲肝病毒下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述基因C型鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；基因C型鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ1。本专利技术还公开了一种上述的引物和探针在制备基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒方面的应用。本专利技术还公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒，包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管；所述荧光定量PCR反应液冻干管包括Taq酶1.5μL、反转录酶1.5μL、上述的基因C型鸭甲肝病毒上游引物、基因C型鸭甲肝病毒下游引物各2.5μL、基因C型鸭甲肝病毒探针0.5μL、dNTPs2.5μL。可选地，所述Taq酶的终浓度为5U·μL-1，反转录酶的终浓度为20U·μL-1，基因C型鸭甲肝病毒上游引物和基因C型鸭甲肝病毒下游引物的终浓度均为10μmol·μL-1，基因C型鸭甲肝病毒探针的终浓度为10μmol·μL-1，dNTPs的终浓度为2.5mM。可选地，所述荧光定量PCR反应液冻干管通过以下方法制备得到：将上述的Taq酶、反转录酶、基因C型鸭甲肝病毒上游引物、基因C型鸭甲肝病毒下游引物和基因C型鸭甲肝病毒探针、dNTPs混合加入0.5ml的PCR管中降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管，制得荧光定量PCR反应液冻干管。可选地，所述荧光定量PCR反应液冻干管设置有50管。可选地，所述反应缓冲液由以下组分构成：500mMKCl、pH8.3、100mMTris-HCl、15mMMgCl2，余量为ddH2O，以上体积总量为3ml。可选地，阳性对照品冻干管通过以下方法制备得到：将含有基因C型鸭甲肝病毒RNA片段的RNA样品100μL装入PCR管内，降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管制备而成；阴性对照品冻干管通过以下方法制备得到：将无基因C型鸭甲肝病毒RNA片段的样品100μL装入PCR管内，降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管制备而成。可选地，该试剂盒保存于4℃下。本专利技术还公开了一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：1)制备RNA模板：取粪便样本上清液200μL，参考金瑞泓捷(厦门)生物科技有限公司的PetNAD试剂盒提取说明书提取被检样本上清总RNA，制备得到RNA模板；2)荧光PCR反应体系的制备：荧光PCR反应体系的制备于冰上操作；取100μL反应缓冲液加入到阳性对照品冻干管中混合，制备得到阳性对照品，然后取50μL反应缓冲液和5μL阳性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中，制备得到阳性对照反应体系；取100μL反应缓冲液加入阴性对照品冻干管中，制备得到阴性对照品，然后取50μL反应缓冲液和5μL阴性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中，制备得到阴性对照反应体系；取50μL反应缓冲液和5μL检测样本RNA加入荧光定量PCR反应液冻干管中，制备得到检测样本RNA反应体系；然后分别从各个反应体系中取50μL混合物移入恒温隔绝式荧光PCR反应管中；加样时注意避光操作；将制备好的荧光定量PCR反应管瞬时高速离心5s，避免出现气泡；3)扩增检测：把PCR反应管放置于恒温隔绝式荧光PCR仪器内，按运行键，即开始反应；4)检测结果判定：“+”表示阳性，“-”表示阴性。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术提供了一种基因C型鸭甲肝病毒的荧光PCR检测试剂盒，其优点是特异性强、灵敏度高、检测时间短、无污染、无需电泳，可在现场快速检测。2)本专利技术能快速、准确地检测出被检样本中的基因C型鸭甲肝病毒RNA，可用于基因C型鸭甲肝病毒的分子流行病学调查。3)本专利技术的荧光定量PCR反应液中包括反转录酶和PCR扩增酶，使核酸的反转录和扩增在同一管中进行，简化了操作，节省了试剂同时闭管操本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：基因C型鸭甲肝病毒上游引物、基因C型鸭甲肝病毒下游引物和基因C型鸭甲肝病毒探针，其中，所述基因C型鸭甲肝病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因C型鸭甲肝病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述基因C型鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；基因C型鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ1。

【技术特征摘要】
1.一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：基因C型鸭甲肝病毒上游引物、基因C型鸭甲肝病毒下游引物和基因C型鸭甲肝病毒探针，其中，所述基因C型鸭甲肝病毒上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述基因C型鸭甲肝病毒下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述基因C型鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；基因C型鸭甲肝病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记，3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ1。2.权利要求1所述的引物和探针在制备基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒方面的应用。3.一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒，其特征在于，包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管；所述荧光定量PCR反应液冻干管包括Taq酶1.5μL、反转录酶1.5μL、权利要求1所述的基因C型鸭甲肝病毒上游引物、基因C型鸭甲肝病毒下游引物各2.5μL、基因C型鸭甲肝病毒探针0.5μL、dNTPs2.5μL。4.根据权利要求3所述的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒，其特征在于，所述Taq酶的终浓度为5U·μL-1，反转录酶的终浓度为20U·μL-1，基因C型鸭甲肝病毒上游引物和基因C型鸭甲肝病毒下游引物的终浓度均为10μmol·μL-1，基因C型鸭甲肝病毒探针的终浓度为10μmol·μL-1，dNTPs的终浓度为2.5mM。5.根据权利要求3或4所述的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应液冻干管通过以下方法制备得到：将权利要求3或4所述的Taq酶、反转录酶、基因C型鸭甲肝病毒上游引物、基因C型鸭甲肝病毒下游引物和基因C型鸭甲肝病毒探针、dNTPs混合加入0.5ml的PCR管中降至-50℃，然后在10pa气压下冻干24h，形成干粉状后闭管，制得荧光定量PCR反应液冻干管。6.根据权利要求5所述的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的基因C型鸭甲肝病毒检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应液冻干管设置有50管。7.根据权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳华，汤承，任玉鹏，王远微，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川,51