用于确定物体的高度位置的方法技术

本发明专利技术涉及一种方法，该方法用于通过显微镜(10)在物体(12)的横向第一位置处确定物体(12)的高度位置，显微镜沿与物体的高度方向对应的z方向利用点扩散函数对物体(12)成像，包括以下步骤：在宽视场中用显微镜(10)对物体(12)成像并确定宽视场强度，通过将宽视场强度(IW)与预定比例因子相乘来计算第一位置处的预期最大强度，在第一位置对物体(12)部分共焦地成像，其中焦点位于景深范围内的z方向的测量位置，并确定第一位置处的部分共焦成像的部分共焦强度，通过在部分共焦强度和宽视场强度与预定的链接因子的乘积之间形成差值来计算(第一位置处的)对应于点扩散函数的强度，使用之前已知的点扩散函数的形式、已算出的对应于点扩散函数的强度以及已算出的预期最大强度，计算点扩散函数取最大值时所处的焦点的z坐标，并使用该z坐标作为物体(12)在第一位置处的高度位置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定物体的高度位置的方法
本专利技术涉及一种通过使用显微镜确定物体的横向的第一位置(erstenOrt)处的物体的高度位置(Hohenlage)的方法，该显微镜利用点扩散函数沿着与高度方向一致的z方向对物体成像。本专利技术还涉及一种用于产生物体的宽视场图像和部分共焦图像的显微镜，其中显微镜包括检测器装置，用于部分共焦成像和用于在宽视场中成像的针孔装置，适用于设置部分共焦图像的焦点的z位置的聚焦装置，以及用于控制针孔装置的控制装置，该控制装置连接到检测器装置。
技术介绍
从现有技术中已知一些方法，其可用于使用光学显微镜确定物体的形貌。特别是，共焦显微镜被用于此。在已知的所述方法中，部分共焦图像的焦点沿z方向移位，即沿着形貌的高度延伸方向移位，并且在每个z位置记录部分共焦图像。部分共焦成像通常被提供为使得图像包括纯共焦分量和宽视场的分量。对于z方向上的每个所述图像确定强度，其也被统称为堆叠，并且计算z方向上的强度分布。在该算出的强度分布的基础上，可以确定最大强度，其z坐标与测量点处的物体的高度位置一致。为了确定物体在一个区域上的高度位置，在各个位置上重复上述方法。为了确定最大强度，通常需要沿z方向进行多次测量，以便获得强度最大值的适当精度，并因此获得物体的高度。因此，该方法可能需要大量的时间。US2004/0008515A1涉及对用于三维分辨显微镜的荧光照射的改进。HiraokaY.等的出版物(Biophys，J.，57卷，1990年2月，第325-333页)解释了在光学显微镜中确定三维成像特性。McNallyJ.等(SPIE，第2984卷，1997年，第52-63页)使用精确已知的测试物体比较了若干3D显微镜方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于快速确定物体的高度位置的系统。该目的通过权利要求1的方法和权利要求13的显微镜来实现。从属权利要求涉及本专利技术的优选实施例。在通过使用显微镜确定在物体的横向的第一位置处的物体的高度位置的方法中，所述显微镜沿着与高度方向一致的z方向利用点扩散函数对物体进行成像，执行以下步骤：使用显微镜在宽视场中对物体成像并确定宽视场强度，通过将宽视场强度乘以预定比例因子来计算第一位置处预期的最大强度，在第一位置处对物体进行部分共焦成像，其中焦点位于z方向上的一测量位置，其中所述部分共焦图像限定景深范围并且所述焦点位于景深范围内，并且确定在所述第一位置处的部分共焦图像的部分共焦强度，通过在部分共焦强度和宽视场强度与预定链接因子的乘积之间作减法运算来计算在第一位置处对应于点扩散函数的强度，使用点扩散函数的预定形式、对应于已算出的点扩散函数的强度和已算出的预期最大强度，计算扩散函数在其处为最大的焦点在z方向上的z坐标，并使用该z坐标作为第一位置处的物体的高度位置。该方法优选地用于确定横向延伸物体的形貌。为此，可以确定多个第一位置处的高度，其中多个第一位置彼此具有横向距离。从而，这些第一位置特别涉及物体的横向范围。这些第一位置优选地垂直于z方向地间隔开。该方法优选地以扫描方式使用，其中要求保护的方法或该方法的部分在每个扫描点处执行，扫描点可以对应于第一位置。物体的形貌可以根据各个第一位置的高度位置被确定。显微镜特别适于以部分共焦的方式对物体成像。在本上下文中，部分共焦旨在表示在z方向上针孔限制成像，但不以衍射限制的方式。然后，针孔的尺寸确定了z方向上的第一位置的区域，该第一位置通过部分共焦成像成像。众所周知，随着针孔尺寸的减小，z方向的分辨率增加。在本上下文中，共焦成像旨在表示针孔具有与成像衍射极限相对应的大小。部分共焦成像尤其包括纯共焦图像和宽视场图像的分量。在部分共焦成像中，针孔尤其大于共焦成像中的针孔。部分共焦成像尤其用于捕获所谓的合成图像。显微镜，特别是其光学器件和针孔的尺寸，确定了z方向上的景深范围。因此，景深范围是显微镜的属性，其可以通过已知方法预先确定。该物体尤其具有其高度变化在纳米至毫米范围内的形貌。物体可以是能够光学成像的任何样品。该物体尤其可以是生物样品。部分共焦图像限定了景深范围。景深范围依赖于针孔的尺寸，其中z方向上的景深范围随着针孔尺寸的增加而增加。因此，共焦成像在z方向上具有比部分共焦成像更小的景深范围。此外，部分共焦成像的景深范围小于宽视场成像的景深范围。如果共焦成像针孔的尺寸进一步减小，则景深范围不会改变，但仅减小共焦图像的强度。宽视场成像旨在特别表示在z方向上没有或具有低的空间分辨率的物体的成像。这可以通过在成像束路径中不提供针孔或具有大直径的针孔来实现，所述成像束路径表示光的束路径，其从第一位置处发射或反射到显微镜的检测器装置。在宽视场成像之后，确定其强度，其对应于宽视场强度。可以在物体的第一位置或任何其他位置处执行宽视场成像，并且宽视场成像优选地用于捕获光学属性，诸如例如样品的反射率。宽视场强度优选地仅确定一次，使得当重复该方法时，利用先前测量的宽视场强度。特别是如果物体是一个在物体的范围内的光学属性(特别是反射率)恒定或近似恒定或变化小于10％、20％或50％的物体，则仅确定一次宽视场强度是合适的。因此，如果重复这里所示的方法，则优选地仅对第一位置进行一次宽视场成像。作为该方法的另一步骤，计算在第一位置处预期的最大强度，其对应于在部分共焦成像或共焦成像中获得的最大强度。该计算基于以下发现：共焦或部分共焦成像中的最大强度与宽视场强度成比例。这种关系对应于比例因子，其优选地预先针对显微镜确定，并且特别是针对物体。如果宽视场强度的确定同样仅执行一次，则可以仅执行一次第一位置处的预期最大强度的计算。因此，重复该方法时，不再次执行预期最大强度的确定。在重复该方法时，特别是在每个第一位置处，执行第一位置处的物体的部分共焦成像。该图像的焦点在z测量位置处提供，该z测量位置位于显微镜的部分共焦成像的景深范围内。特别地，z测量位置位于通过共焦成像建立的景深范围内。z测量位置的选择优选地是随机的，或者相同的z测量位置用于在每个第一位置处的部分共焦成像。建立z测量位置使得其位于部分共焦图像的景深范围内可以通过试错或手动实现。特别是，物体或显微镜的其他已知参数可用于确定部分共焦成像的景深范围。由部分共焦成像确定的部分共焦强度可以优选地用于发现z测量位置是否位于景深范围内。如果不是这种情况，则可以重复该方法的步骤，直到确定z测量位置位于部分共焦成像的景深范围内。部分共焦成像优选地通过在成像束路径中提供针孔来实施。从而，与宽视场图像相比，部分共焦成像在z方向上具有更好的分辨率。由于显微镜的点扩散函数是可以被确定的这一事实，所以特别是点扩散函数的精确轮廓或分布是已知的，例如点扩散函数与高斯曲线和标准宽度的偏差。纯共焦成像优选地利用点扩散函数对物体成像。点扩散函数的最大强度特别是指与点扩散函数对应的强度。与点扩散函数的最大强度一致或重合的z方向上的z测量位置可以基于以下假设来计算，即，假设第一位置处的部分共焦成像的强度等于在第一位置处共焦成像的强度与宽视场强度乘以链接因子的加和。优选在执行该方法之前，对于例如被观察的物体或通用地对于显微镜，确定链接因子。根据这种关系，使得根据测量的变量，特别是部分共焦强度和宽视场强度，计算对应于点扩散函数的第一位置处的强度是可能的。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过使用显微镜(10,，100，200)确定物体(12)在物体(12)的横向的第一位置处的高度位置的方法，所述显微镜沿着与高度方向一致的z方向利用点扩散函数(PSF)对物体(12)成像，所述方法包括以下步骤：‑在宽视场中用显微镜(10，100，200)对物体(12)成像并确定宽视场强度(IW)，‑通过将宽视场强度(IW)乘以预定的比例因子(Sk)来计算在所述第一位置预期的最大强度(Imax*)，‑在所述第一位置对物体(12)进行部分共焦成像，其中焦点位于z方向上的测量位置(z1)，其中部分共焦成像限定景深范围并且焦点在景深范围内，并确定所述第一位置处的部分共焦图像的部分共焦强度(I1)，‑通过在部分共焦强度(I1)与宽视场强度(IW)和预定链接因子(Vk)的乘积之间进行减法运算，计算第一位置处的与点扩散函数(PSF)对应的强度(I1*)，‑使用点扩散函数(PSF)的预定形式、已算出的对应于点扩散函数(PSF)的强度(I1*)和已算出的预期最大强度(Imax*)计算焦点的z坐标(zh)，点扩散函数(PSF)在所述焦点处取最大值，和‑使用所述z坐标(zh)作为物体(12)在所述第一位置处的高度位置。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.02 DE 102016103736.21.一种通过使用显微镜(10,，100，200)确定物体(12)在物体(12)的横向的第一位置处的高度位置的方法，所述显微镜沿着与高度方向一致的z方向利用点扩散函数(PSF)对物体(12)成像，所述方法包括以下步骤：-在宽视场中用显微镜(10，100，200)对物体(12)成像并确定宽视场强度(IW)，-通过将宽视场强度(IW)乘以预定的比例因子(Sk)来计算在所述第一位置预期的最大强度(Imax*)，-在所述第一位置对物体(12)进行部分共焦成像，其中焦点位于z方向上的测量位置(z1)，其中部分共焦成像限定景深范围并且焦点在景深范围内，并确定所述第一位置处的部分共焦图像的部分共焦强度(I1)，-通过在部分共焦强度(I1)与宽视场强度(IW)和预定链接因子(Vk)的乘积之间进行减法运算，计算第一位置处的与点扩散函数(PSF)对应的强度(I1*)，-使用点扩散函数(PSF)的预定形式、已算出的对应于点扩散函数(PSF)的强度(I1*)和已算出的预期最大强度(Imax*)计算焦点的z坐标(zh)，点扩散函数(PSF)在所述焦点处取最大值，和-使用所述z坐标(zh)作为物体(12)在所述第一位置处的高度位置。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具有大于衍射极限的开口的针孔装置(18，118，218)被用于部分共焦成像，使得部分共焦成像的部分共焦强度(I1)具有宽视场成像的分量。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过执行以下步骤来确定比例因子(Sk)：-通过使焦点位置在z方向上反复地移位并在每个焦点位置对第一校准物体或物体(12)的横向的第一校准位置进行部分共焦成像来产生z-堆叠，并确定每个这样获得的部分共焦图像的部分共焦强度，-计算所述第一校准位置处的z方向强度分布，并确定所述第一校准位置处的所述强度分布的最大校准强度(Ikmax)，-使用显微镜(10，100，200)在宽视场中对所述第一校准位置成像，并确定所述第一校准位置处的第一校准宽视场强度(IkW1)，以及-计算比例因子(Sk)，所述比例因子是最大校准强度(Ikmax)与第一校准宽视场强度(IkW1)之间的比率。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过执行以下步骤来确定链接因子(Vk)：-对第二校准物体或物体(12)的横向的第二校准位置进行部分共焦成像，其中焦点位于z方向上的校准测量位置(zk1)，所述校准测量位置在景深范围内，并确定所述第二校准位置处的部分共焦图像的校准强度(Ik1)，-对第二校准位置进行共焦成像，其中焦点位于校准测量位置(zk1)，并确定第二校准位置处的共焦图像的共焦校准强度(Ik1*)，-使用显微镜(10，100，200)在宽视场中对第二校准位置进行成像，并确定第二校准位置处的第二校准宽视场强度(IkW2)，以及-计算链接因子(Vk)，所述链接因子是部分共焦校准强度(Ik1)和共焦校准强度(Ik1*)之间的差值与第二校准宽视场强度(IkW2)之间的比率。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，使用显微镜(10，100，200)在宽视场中对所述第一位置进行成像，并且确定所述第一位置处的宽视场强度(IW)。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于以下步骤：-对所述第一位置进行部分共焦成像，其中焦点位于至少两个测量位置(z1，z2)，所述两个测量位置在z方向上间隔开并位于景深...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼尔斯·兰厚哲，维克多·德雷舍尔，
申请(专利权)人：卡尔蔡司显微镜有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE