金钗石斛总生物碱的提取及纯化和含量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种金钗石斛总生物碱的提取及纯化和含量测定方法，属于生物医药技术领域。其包含1).称取金钗石斛，粉碎；2).溶剂浸泡煎煮；3).酸液处理；4).萃取浓缩；5).再次酸液处理；6).柱层析分离提纯；7).真空冷冻干燥。本发明专利技术方法提取纯化的金钗石斛总生物经气象色谱测定法和酸性染料比色测定法测定，石斛总生物碱含量为80‑90％，效果突出。

【技术实现步骤摘要】
金钗石斛总生物碱的提取及纯化和含量测定方法
本专利技术涉及医药
，具体为一种金钗石斛总生物碱的提取及纯化和含量测定方法。
技术介绍
金钗石斛是我国传统医学中的名贵中药材，被誉为“神仙草”。据《神农本草经》中记载，金钗石斛有养胃生津、滋阴清热、润肺止咳和明目等功效。现代医学研究表明金钗石斛的主要化学成分有多糖、生物碱、菲类、酚类、香豆素、甾体、维生素、氨基酸、挥发油等。生物碱使其特征性成分，主要有抗白内障、免疫调节、降血糖、抗肿瘤、兴奋胃肠道、抗氧化、抗疲劳等。研究金钗石斛有效成分的提取、纯化和测定对现代医药发展尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种金钗石斛总生物碱的提取及纯化和含量测定方法。为达到上述目的，采用的技术方案为：金钗石斛总生物碱的提取纯化方法，其特征在于包含以下步骤：1).称取金钗石斛，粉碎后备用；2).用溶剂将金钗石斛粉分别浸泡煎煮2-3次，每次2小时，过滤合并滤液；3).将步骤2)所得滤液用pH＝3.5的盐酸溶液处理，搅拌充分后过滤，收集滤液；4).将步骤3)所得滤液用石油醚按1:1的比例萃取，去石油醚层，再用氨水调节液体至pH＝10，再用氯仿按1.2:1比例萃取两次，收集氯仿层，浓缩后制得膏状；5).将步骤4)制得的浸膏用双蒸水配制的pH为2-3.5的盐酸溶液处理，过滤，收集滤液；6).将步骤5)所得滤液用钠型离子交换树脂柱分离提纯，用蒸馏水冲洗至无色，再用60％-85％的乙醇冲洗至无色，再用25％氨水加在80％的乙醇里面调pH为10-11后冲洗柱子，用10％硅钨酸检测，浓缩冲洗液，制得金钗石斛总生物碱；7).将步骤6)制得的金钗石斛总生物碱用真空冷冻干燥机干燥，即得。上述步骤2)中，溶剂为90-95％的乙醇，使用的金钗石斛与乙醇的重量比为1:2.5-10。金钗石斛总生物碱的含量的气象色谱测定方法，包含以下步骤：1).色谱条件色谱柱：HP-55％PhenylMethylSiloxan石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；柱温80℃,保持5min,以10℃/min上升至250℃,保留5min；载气:N2,1mL/min；分流比为10:1；气化室温度:230℃,检测器FID；检测器温度:250℃；氢气:30mL/min；空气:400mL/min；尾吹:25mL/min；进样方式:自动进样；进样量：0.1μL；2).标准曲线的制备称取对照品石斛碱1.00mg于5mL容量瓶中,加少量甲醇溶解,并稀释至刻度；用移液枪分别吸50、100、150、200、250、300、350μL的标准品溶液于进样瓶中，然后分别加甲醇450、400、350、300、250、200、150μL；以上操作均在冰上进行，进样测定；以峰面积Y对石斛碱浓度X进行线性回归，得回归方程Y＝198.15X-3.5639,r＝0.9998,在20～140μg/mL有良好的线性关系；3).供试品的制备称取供试品金钗石斛总生物碱1.00mg于5ml容量瓶中，加少量甲醇溶解，并稀释到刻度，用移液枪吸250ml于进样瓶中，然后加甲醇250ml，测其峰面积。金钗石斛总生物碱的含量的酸性染料比色测定方法，其包含以下步骤：1).标准曲线的制备精密称取石斛碱对照品1.00mg，置100mL容量瓶中，先用少量三氯甲烷溶解，然后定容至刻度；用移液枪分别取50、100、150、200、250、300、350μL于1.5mL带盖的玻璃瓶中，然后分别加三氯甲烷450、400、350、300、250、200、150μL；加入pH4.5缓冲液250μL和0.04％溴甲酚绿溶液100μL，剧烈振摇3min，静置30min，分层后取下层三氯甲烷液100μL于96孔石英玻璃板，加0.01mol/LNaOH-无水乙醇溶液20μL，摇匀，以上操作均在冰上进行；同时，取三氯甲烷500μL，同法操作，作为空白对照，于酶标仪620nm处测定吸光度；以石斛碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线；得回归方程A＝23.714C+0.0471,r＝0.9992，在1～5μg/mL有良好的线性关系；2).金钗石斛总生物碱样品的测定称取供试品金钗石斛总生物碱1.00mg，置100mL容量瓶中，先用少量三氯甲烷溶解，然后定容至刻度；用移液枪取200μL于1.5mL带盖的玻璃瓶中，加三氯甲烷300μL，摇匀，作为样品液，其余操作按上述步骤1)方法进行本专利技术方法提取纯化的金钗石斛总生物碱经上述含量测定方法测定，石斛总生物碱含量为80-90％，效果突出。具体实施方式下面结合实施例进一步介绍本专利技术，但本专利技术不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。实施例一1.金钗石斛总生物碱的提取：1.1称取金钗石斛20斤,粉碎，每5斤用乙醇煎煮三次，(每次乙醇沸腾计时2h)，第一次用95％的乙醇40公斤(第一次要浸泡一天)，第二、第三用90％的乙醇25公斤。1.2浓缩过后让乙醇充分挥发至无乙醇味得浸膏，用pH＝3.5盐酸溶液(大概20公斤)与浸膏充分混匀，并用搅拌器搅拌一天，过滤，待用。2.金钗石斛总生物碱的纯化:2.1上述过滤液先用石油醚按1:1的比例萃取过滤液(去石油醚层)。2.2用氨水调节酸水处理液至pH＝10,用氯仿与碱水液(1.2:1)萃取两次，收集氯仿层，浓缩到膏状。2.3浸膏在用双蒸水配制的盐酸溶液(pH＝2-3.5)处理,过滤，滤液上离子交换树脂(钠型),先用蒸馏水冲洗至无色，在用60％-85％的乙醇冲洗至无色，无色后用25％氨水加在80％的乙醇里面调pH为10-11后冲洗柱子，用10％硅钨酸检测，浓缩冲洗液，的石斛总生物碱。2.4把上述金钗石斛总生物碱可以用真空冷冻干燥机干燥。实施例二1.金钗石斛总生物碱的提取:1.1称取金钗石斛20斤,粉碎，每5斤用乙醇煎煮三次，(每次乙醇沸腾计时2h)，第一次用95％的乙醇40公斤(第一次要浸泡一天)，第二、第三用90％的乙醇25公斤。1.2浓缩过后让乙醇充分挥发至无乙醇味得浸膏，用pH＝3.5盐酸溶液(大概20公斤)与浸膏充分混匀，并用搅拌器搅拌一天，过滤，待用。1.2浓缩过后让乙醇充分挥发至无乙醇味得浸膏，用pH＝3.5盐酸溶液(大概20公斤)与浸膏充分混匀，并用搅拌器搅拌一天，过滤，待用。2.金钗石斛总生物碱的纯化:2.1将步骤1.2的滤液上离子交换树脂(钠型)，先用蒸馏水冲洗至无色，在用60％-85％的乙醇冲洗至无色，无色后用25％氨水加在80％的乙醇里面冲洗柱子，用10％硅钨酸检测，浓缩冲洗液，的石斛总生物碱。2.2把上述金钗石斛总生物碱可以用真空冷冻干燥机干燥。实施例三1.金钗石斛总生物碱的提取:1.1称取金钗石斛20斤,粉碎，分四批煎煮，每批煎煮两次，第一次用盐酸溶液(Ph＝2-4)10倍的量，第二次8倍的量，每次煎煮2小时，过滤，待用2.金钗石斛总生物碱的纯化2.1滤液上阳离子交换树脂(钠型)，先用蒸馏水冲洗至无色，在用60％-85％的乙醇冲洗至无色，无色后用25％氨水加在80％的乙醇里面冲洗柱子，用10％硅钨酸检测，浓缩冲洗液，的石斛总生物碱。2.2把上述金钗石斛总生物碱可以用真空冷冻干燥机干燥。实施例四1金钗石斛总生物碱的提取:1.1称取金钗石斛2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金钗石斛总生物碱的提取纯化方法，其特征在于包含以下步骤：1).称取金钗石斛，粉碎后备用；2).用溶剂将金钗石斛粉分别浸泡煎煮2‑3次，每次2小时，过滤合并滤液；3).将步骤2)所得滤液用pH＝3.5的盐酸溶液处理，搅拌充分后过滤，收集滤液；4).将步骤3)所得滤液用石油醚按1:1的比例萃取，去石油醚层，再用氨水调节液体至pH＝10，再用氯仿按1.2:1比例萃取两次，收集氯仿层，浓缩后制得膏状；5).将步骤4)制得的浸膏用双蒸水配制的pH为2‑3.5的盐酸溶液处理，过滤，收集滤液；6).将步骤5)所得滤液用钠型离子交换树脂柱分离提纯，用蒸馏水冲洗至无色，再用60％‑85％的乙醇冲洗至无色，再用25％氨水加在80％的乙醇里面调pH为10‑11后冲洗柱子，用10％硅钨酸检测，浓缩冲洗液，制得金钗石斛总生物碱；7).将步骤6)制得的金钗石斛总生物碱用真空冷冻干燥机干燥，即得。

【技术特征摘要】
1.一种金钗石斛总生物碱的提取纯化方法，其特征在于包含以下步骤：1).称取金钗石斛，粉碎后备用；2).用溶剂将金钗石斛粉分别浸泡煎煮2-3次，每次2小时，过滤合并滤液；3).将步骤2)所得滤液用pH＝3.5的盐酸溶液处理，搅拌充分后过滤，收集滤液；4).将步骤3)所得滤液用石油醚按1:1的比例萃取，去石油醚层，再用氨水调节液体至pH＝10，再用氯仿按1.2:1比例萃取两次，收集氯仿层，浓缩后制得膏状；5).将步骤4)制得的浸膏用双蒸水配制的pH为2-3.5的盐酸溶液处理，过滤，收集滤液；6).将步骤5)所得滤液用钠型离子交换树脂柱分离提纯，用蒸馏水冲洗至无色，再用60％-85％的乙醇冲洗至无色，再用25％氨水加在80％的乙醇里面调pH为10-11后冲洗柱子，用10％硅钨酸检测，浓缩冲洗液，制得金钗石斛总生物碱；7).将步骤6)制得的金钗石斛总生物碱用真空冷冻干燥机干燥，即得。2.根据权利要求1所述的金钗石斛总生物碱的提取及纯化和含量测定方法，其特征是：所述步骤2)中，溶剂为90-95％的乙醇，使用的金钗石斛与乙醇的重量比为1:2.5-10。3.一种金钗石斛总生物碱的含量的气象色谱测定方法，其特征在于包含以下步骤：1).色谱条件色谱柱：HP-55％PhenylMethylSiloxan石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；柱温80℃,保持5min,以10℃/min上升至250℃,保留5min；载气:N2,1mL/min；分流比为10:1；气化室温度:230℃,检测器FID；检测器温度:250℃；氢气:30mL/min；空气:400mL/min；尾吹:25mL/min；进样方式:自动进样；进样量：0.1μL；2).标准曲线的制备称取对照品石斛碱1.00mg于5mL容量瓶中,加少量甲醇溶解,并稀释至刻度；用移液枪分别吸50、100、...

【专利技术属性】
技术研发人员：石京山，张茂生，杨文进，张玮，张成宸，王丽娜，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52