直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法技术

本发明专利技术公开了一种可直接同时检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，以茶鲜叶、茶在制品、或成品茶作为待测样品，依次进行以下步骤：1)、待测样品中糖苷结合态香气前体提取，2)、提取物中糖苷结合态香气前体UPLC‑MS/MS分析，3)、茶叶糖苷结合态香气前体物质含量计算：以4‑硝基苯基‑β‑D‑葡萄糖苷内标为参照，获得苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3‑己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物樱草糖苷III、芳樟醇樱草糖苷、香叶醇樱草糖苷这9种糖苷结合态香气前体的物质含量。该方法对糖苷结合态香气前体物质检测效率高。

【技术实现步骤摘要】
直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法
本专利技术涉及一种茶中糖苷结合态香气前体物质的检测方法，具体的说是一种利用超高压液相色谱-质谱/质谱(UPLC-MS/MS)多反应监测模式(MRM)直接对茶树鲜叶、茶叶在制品以及干茶的糖苷结合态香气前体物质进行快速、高效检测的方法。
技术介绍
香气是重要的茶叶品质因子。茶中的香气成分主要包括醇类、醛类、酮类、酯类、杂环化合物等，其中醇类化合物是最为重要的香气组份。茶叶醇类香气物质又可分为萜烯醇、芳香醇和脂肪醇三类化合物，而且萜烯醇和芳香醇常具有花香特征，对茶叶的香气品质有重要贡献。茶叶中常见的萜烯醇有芳樟醇、芳樟醇氧化物(I、II、III、IV)、香叶醇、橙花醇、橙花叔醇等，芳香醇有苯甲醇和苯乙醇等，脂肪醇有顺3-己烯醇、庚醇、辛醇等。已有研究证实，成品茶香气主要有4种来源，其一为糖苷结合态前体水解、释放出挥发性香气，其二为长链脂肪酸通过脂氧合酶催化或自由基氧化途径形成挥发性短链脂肪醇，其三为在湿热作用下通过羰氨反应形成吡嗪、吡喃等杂环化合物，其四为茶鲜叶中既已存在的游离态香气物质，其中糖苷结合态前体水解是茶叶香气形成的最关键途径。因此糖苷结合态前体是茶叶香气潜力的重要表征成分，糖苷结合态香气前体的快速提取和准确检测方法建立对茶树品种香气品质潜力客观评价以及高香茶叶栽培加工配套技术开发有重要意义。虽然糖苷结合态前体物质对茶叶香气贡献显著，但这类物质在茶鲜叶或者成品茶中丰度很低，分离和纯化非常困难，而且这类物质紫外吸收弱、甚至无紫外吸收，因而较难直接、准确地定性和定量。目前，茶叶糖苷结合态香气前体物质的检测主要采用酶解与气相-质谱联用(GC-MS)相结合方法、或者糖苷结合态香气前体衍生与GC-MS相结合方法、或者采用超高压液相色谱-质谱(UPLC-MS)单离子监测模式(SIM)方法等进行。其中，酶解与GC-MS检测技术，需要将茶样品中的游离态和糖苷结合态香气前体用水或缓冲液浸提出来、并用乙醚等溶剂反复萃取除去游离态的香气物质，将含有糖苷结合态香气前体的提取液与葡萄糖苷酶或果胶酶等混合、水解并释放香气物质，再用固相微萃取(SPME)或同时蒸馏萃取(SDE)等方式富集香气物质，进而通过GC-MS对萃取的香气物质进行定性和定量，这种测定方法只能间接推定结合态糖苷前体的苷元性质，不能获得糖基的信息，而且在糖苷酶解以及释放的香气富集过程中往往还存在水解不彻底、富集不完全等问题。糖苷结合态香气前体衍生与GC-MS结合分析法，主要过程为，提取和纯化茶叶等样品中的糖苷结合态香气前体，并充分干燥后与三氟乙酰胺试剂或硅烷化试剂混合进行衍生化处理引入挥发性乙酰基或硅烷基团，经GC-MS分析对衍生转化后的前体物质进行定性和定量；该方法可以获得糖苷结合态香气前体的较为完整的结构信息，但是纯化前体物质过程繁琐，而且分析数据后续处理复杂，因为GC-MS获得的是衍生后的糖苷物质信息，还需要解卷积等过程还原获得的原始糖苷前体信息。利用UPLC-MS的SIM检测糖苷结合态香气前体时，需要将茶叶中的糖苷结合态香气前体浸提出来、并通过柱层析等手段纯化后，经UPLC分离，根据糖苷结合态前体分子量特点采用SIM对单个目标物进行信号采集和定量；这种方法虽然可以直接测定糖苷结合态香气前体物质，但是，前体物质提取和纯化过程繁琐，需要尽可能多的去掉干扰性杂质，因为在前体提取物中往往存在分子量相似的干扰物质；而且这种分析方法通量低，每次只能检测一种糖苷结合态香气前体物质，一个样品需要经过多次检测才能将所含前体物质完全检测出来。到目前为止，尚缺乏快速直接的茶叶糖苷结合态香气前体物质的高效检测方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可以同时检测茶叶9种糖苷结合态香气前体物质的方法。该方法具有样品用量少、提取操作简单、分析快速高效、适用范围广等优点。为了解决该技术问题，本专利技术提供一种直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法(即，利用UPLC-MS/MSMRM模式同时检测9种糖苷结合态香气前体物质的方法)，以茶鲜叶、或茶在制品、或成品茶作为待测样品，依次进行以下步骤：1)、待测样品中糖苷结合态香气前体提取：将相当于0.05-0.1g干重的待测样品利用20mL提取剂进行提取，提取液经离心，得上清液；所述提取剂为预冷(-5℃)的体积浓度为90-95％甲醇；在上清液中添加3μg4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷作为内标，并加入0.1-0.2g经超纯水预溶胀的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP充分混匀(以沉淀多酚)，静置后离心(静置时间为60min，10000±2000r/min离心10±2min)，离心所得的上清浓缩至干，得浸膏(为含糖苷结合态香气前体物质的浸膏)；将浸膏溶于1-2mL超纯水中，并过0.22μm微孔滤膜，得茶叶糖苷结合态香气前体提取物；2)、提取物中糖苷结合态香气前体UPLC-MS/MS分析：以UPLCHSST3色谱柱(150mm×2.1mm，1.8μ)为分析柱，柱温35℃，进样量5ul；以甲酸/水(0.05/99.95，v/v)为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.3ml/min，洗脱时间程序为0-3minB相保持10％、3.01-15minB相从10％增加至20％、15.01-20minB相从20％增加至35％、20.01-22minB相从35％增加至90％、22.01-24minB相保持90％、24.01-26minB相保持10％；MS分析条件为：电喷雾ESI负电离模式、毛细管电压3KV、二级锥孔电压3V、透镜电压0.2V、离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃、脱溶剂气流量800L/h、锥孔气流量60L/h、锥孔电压25V、碰撞气氩气流速0.25mL/min、扫描质荷比范围为100～700m/z、数据采集时间为26min；在4-9min对应的通道1中以离子对346/138检测内标4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、以离子对447/269检测苯甲醇樱草糖苷、以离子对491/293检测水杨酸甲酯樱草糖苷，在7-13min对应的通道2中以离子对461/149检测苯乙醇樱草糖苷、以离子对439/149检测顺3-己烯醇樱草糖苷、以离子对509/331检测芳樟醇氧化物(I和II)樱草糖苷，在13-17min对应的通道3中以离子对509/331检测芳樟醇氧化物III樱草糖苷，在17-23min对应的通道4中以离子对493/161检测芳樟醇樱草糖苷、以离子对493/149检测香叶醇樱草糖苷；具体而言，在上述UPLC分离和MS分析条件下，可检测到4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷内标以及茶叶苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物(I、II、III)樱草糖苷、芳樟醇樱草糖苷以及香叶醇樱草糖苷等糖苷结合态香气前体的清晰信号。其中，4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷母离子质荷比为m/z346和300，m/z346是该化合物和甲酸根的耦合离子[M+HCOO]-，m/z300为该化合物的去氢离子[M-H]-，且母离子质荷比m/z346信号显著强于m/z300，m/z346母离子的二级子离子为m/z300、138；苯甲醇樱草糖苷母离子质荷比为m/z447(即[M+HCOO]本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，其特征是：以茶鲜叶、或茶在制品、或成品茶作为待测样品，依次进行以下步骤：1)、待测样品中糖苷结合态香气前体提取：将0.05‑0.1g干重的待测样品利用20mL提取剂进行提取，提取液经离心，得上清液；所述提取剂为预冷的体积浓度为90‑95％甲醇；在上清液中添加3μg 4‑硝基苯基‑β‑D‑葡萄糖苷作为内标，并加入0.1‑0.2g经超纯水预溶胀的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP充分混匀，静置后离心，离心所得的上清浓缩至干，得浸膏；将浸膏溶于1‑2mL超纯水中，并过0.22μm微孔滤膜，得茶叶糖苷结合态香气前体提取物；2)、提取物中糖苷结合态香气前体UPLC‑MS/MS分析：以UPLC HSST3色谱柱为分析柱，柱温35℃，进样量5ul；以甲酸/水(0.05/99.95，v/v)为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.3ml/min，洗脱时间程序为0‑3min B相保持10％、3.01‑15min B相从10％增加至20％、15.01‑20min B相从20％增加至35％、20.01‑22min B相从35％增加至90％、22.01‑24min B相保持90％、24.01‑26min B相保持10％；MS分析条件为：电喷雾ESI负电离模式、毛细管电压3KV、二级锥孔电压3V、透镜电压0.2V、离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃、脱溶剂气流量800L/h、锥孔气流量60L/h、锥孔电压25V、碰撞气氩气流速0.25mL/min、扫描质荷比范围为100～700m/z、数据采集时间为26min；在4‑9min对应的通道1中以离子对346/138检测内标4‑硝基苯基‑β‑D‑葡萄糖苷、以离子对447/269检测苯甲醇樱草糖苷、以离子对491/293检测水杨酸甲酯樱草糖苷，在7‑13min对应的通道2中以离子对461/149检测苯乙醇樱草糖苷、以离子对439/149检测顺3‑己烯醇樱草糖苷、以离子对509/331检测芳樟醇氧化物(I和II)樱草糖苷，在13‑17min对应的通道3中以离子对509/331检测芳樟醇氧化物III樱草糖苷，在17‑23min对应的通道4中以离子对493/161检测芳樟醇樱草糖苷、以离子对493/149检测香叶醇樱草糖苷；3)、茶叶糖苷结合态香气前体物质含量计算：以4‑硝基苯基‑β‑D‑葡萄糖苷内标为参照，获得苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3‑己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物樱草糖苷III、芳樟醇樱草糖苷、香叶醇樱草糖苷这9种糖苷结合态香气前体的物质含量。...

【技术特征摘要】
1.直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，其特征是：以茶鲜叶、或茶在制品、或成品茶作为待测样品，依次进行以下步骤：1)、待测样品中糖苷结合态香气前体提取：将0.05-0.1g干重的待测样品利用20mL提取剂进行提取，提取液经离心，得上清液；所述提取剂为预冷的体积浓度为90-95％甲醇；在上清液中添加3μg4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷作为内标，并加入0.1-0.2g经超纯水预溶胀的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP充分混匀，静置后离心，离心所得的上清浓缩至干，得浸膏；将浸膏溶于1-2mL超纯水中，并过0.22μm微孔滤膜，得茶叶糖苷结合态香气前体提取物；2)、提取物中糖苷结合态香气前体UPLC-MS/MS分析：以UPLCHSST3色谱柱为分析柱，柱温35℃，进样量5ul；以甲酸/水(0.05/99.95，v/v)为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.3ml/min，洗脱时间程序为0-3minB相保持10％、3.01-15minB相从10％增加至20％、15.01-20minB相从20％增加至35％、20.01-22minB相从35％增加至90％、22.01-24minB相保持90％、24.01-26minB相保持10％；MS分析条件为：电喷雾ESI负电离模式、毛细管电压3KV、二级锥孔电压3V、透镜电压0.2V、离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃、脱溶剂气流量800L/h、锥孔气流量60L/h、锥孔电压25V、碰撞气氩气流速0.25mL/min、扫描质荷比范围为100～700m/z、数据采集时间为26min；在4-9min对应的通道1中以离子对346/138检测内标4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、以离子对447/269检测苯甲醇樱草糖苷、以离子对491/293检测水杨酸甲酯樱草糖苷，在7-13min对应的通道2中以离子对461/149检测苯乙醇樱草糖苷、以离子对439/149检测顺3-己烯醇樱草糖苷、以离子对509/331检测芳樟醇氧化物(I和II)樱草糖苷，在13-17min对应的通道3中以离子对509/331检测芳樟醇氧化物III樱草糖苷，在17-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆建良，李达，马一校，胡慈杰，郑新强，叶俭慧，梁月荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33