一种模拟生物组织薄片、其制备方法及其应用与装置制造方法及图纸

本发明专利技术属于分析检测技术领域，涉及一种模拟生物组织薄片、其制备方法及其应用与装置。所述模拟生物组织薄片，形态规则、尺寸可控，主要由生物组织材料和组织细胞两部分组成，并含有已知量的目标分子，可以理想地模拟真实生物组织切片的基质。所述制备方法快速简便，可重复性高。所述模拟生物组织标准薄片制备装置，可以实现模拟生物组织自动化制备。本发明专利技术所制备的模拟生物组织薄片，为药物、诊断标志物等目标分子的定量质谱成像分析和质谱高通量快速检测提供了一种稳定、可控的标准生物组织样品。在临床前药物研发、临床疾病诊断领域具有重要应用价值。

A thin slice for simulating biological tissue, preparation method, application and device thereof

The invention belongs to the technical field of analysis and detection, and relates to a slice of simulated biological tissue, a preparation method thereof, and an application and device thereof. The biomimetic tissue sheet, with regular morphology and controllable size, is mainly composed of biological tissue material and tissue cells, and contains a known amount of target molecules, and can ideally simulate the matrix of real biomimetic tissue slices. The preparation method is fast and simple, and has high repeatability. The simulated biological tissue standard slice preparation device can realize the automatic preparation of simulated biological tissue. The biomimetic tissue sheet prepared by the invention provides a stable and controllable standard biological tissue sample for quantitative mass spectrometry imaging analysis and high throughput rapid detection of target molecules such as drugs and diagnostic markers. It has important application value in the field of pre clinical drug research and clinical diagnosis.

【技术实现步骤摘要】
一种模拟生物组织薄片、其制备方法及其应用与装置
本专利技术属于生物分析检测
，涉及一种模拟生物组织薄片、其制备方法及其应用与装置，应用于定量质谱成像分析及质谱快速检测。技术背景质谱成像技术是一种基于质谱分析，对待测样品(多为生物组织)表面上的多种分子按空间位置进行检测、获取其质荷比强度与位置关系并形成多维数据，通过数据处理与软件重构对离子强度进行图像可视化，最终实现多分子的同时检测并显示其空间分布的分子影像技术。它无需放射性同位素、荧光或免疫标记，可以直接获得如细胞、组织等生物样本表面的复杂基质中多肽、蛋白质、脂类、药物及其它小分子代谢物等多种内源性和外源性化合物的类型、含量和空间分布信息。在新药研发、疾病分子诊断等生命科学研究领域具有巨大的应用前景。生物组织切片作为临床诊断、药物研发等领域重要的检测样本，其组织形态及内含的蛋白质、糖类、脂类、酶类、核酸与某些金属元素等不同类别的化学成分，不仅可以为癌症等疾病的分期、分型诊断提供依据，还可以反映受试药物对病变组织的修复(疗效)或器质性损伤(毒性)等情况。以生物组织切片作为研究对象，通过质谱成像技术进行疾病诊断或药物的药效与毒性评价时，目标分子(疾病诊断标志物、候选药物等)的含量信息与疾病发生、发展进程、以及药物的药效与毒性作用直接相关。然而，受组织基质效应的影响，单纯以目标分子的离子信号强弱并不能准确反映其绝对含量信息。因此，需要构建一种目标分子含量可控且均质化的模拟生物组织，为实际生物组织切片中目标分子的绝对定量检测提供一种参照样品。一种理想的定量用模拟生物组织薄片，应具有如下特点：(1)组织结构应具有“均质性”，其目标分子和内源性成分应呈均匀分布；(2)尽可能真实模拟目标分子与生物组织之间的相互作用；(3)生物组织尺寸规则，组织密度和目标成分含量准确可控；(4)模拟组织制备方法稳定、重复性好，精密度高。如何构造一种目标分子掺入量可控且接近于实际生物组织的模拟参照样品，是定量分析生物组织表面目标分子的关键问题与难点。目前，在生物组织内目标成分的定量分析方法研究中，主要基于“组织匀浆混合”(in-tissuestrategy)和“组织表层添加”(on-tissuestrategy)两种策略来构建含目标分子的模拟生物组织，前者主要是将外源性目标分子掺入到经分散处理的组织匀浆液中，再制备冰冻切片的方法实现；后者又分为滴加法和喷涂法：滴加法采用口径极细的微量移液枪将不同浓度的目标分子滴加至组织表面不同区域；喷涂法采用一种商品化的基质喷涂器将稳定同位素标记的目标分子作为内标，均匀喷涂于组织样品表面。然而，上述制备方案均有不足之处：使用匀浆切片法制备模拟组织，匀浆组织冰冻块的质地松软易碎，不易切制，样本间切片形状、面积难以一致，且在组织匀浆的过程中细胞破损率极高，难以模拟目标分子与实际组织之间的相互作用；采用微量移液枪将目标分子滴加于组织表面的方法，并不适用于微小尺寸的组织样本，且目标分子滴加到哪一个器官层面、组织微区完全由操作者选择，而不同组织区域的特异性基质效应对目标分子的影响并不相同，因此难以保证不同批次样本之间的结果平行性；均匀喷涂的方法虽能保证目标分子的均匀涂布，但由于目标分子分布于生物组织切片的表层，并未完全深透至组织深层，组织基质效应对于其信号响应强度的影响明显低于实际生物样品对目标分子的影响。针对上述模拟组织样品制备方法的不足，本专利技术采用“分级平行处理-混合重构”的策略，将构成生物组织的核心要素：细胞、胞外间质成分、天然高分子骨架系统(如纤维蛋白、胶原蛋白、层黏蛋白等)，重新整合为一个与实际生物组织的分子组成类似的模拟生物组织。该方法既能有效地避免匀浆均质化操作造成的细胞破损现象，又可以实现相同的组织均质化效果。制备出的一系列目标分子含量已知的模拟生物组织样品，在组织形态学、组织密度、与目标化合物分子的相互作用等方面与实际生物组织切片无统计学上的显著性差异，因此可用于对生物组织切片样本中目标化合物分子的定量检测分析。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题之一是提供一种目标分子含量可控、均匀分布的模拟生物组织薄片及其制备方法和应用，为准确阐明目标分子在不同生物组织中的含量与其离子信号强弱之间的量化关系提供标准参照。此模拟生物组织薄片样品可应用于对生物组织切片样本中目标化合物分子进行定量检测分析。本专利技术解决的技术问题之二是提供一种制备模拟生物组织薄片的装置。为解决本专利技术的技术问题，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术技术方案的第一方面是提供了模拟生物组织薄片的制备方法，主要包括以下步骤：(i)赋形膜材的加工：选取适宜高分子聚合物材料刻制塑形用模具，确定模拟生物组织的形状、尺寸以及样本布局；(ii)含化合物的水性分散介质的制备：向水性介质中加入适量已知浓度的标准化合物溶液，超声除去水性分散介质中的气泡，待用；(iii)组织料液的制备：将生物组织的分散处理，确定生物组织材料的质量和水性分散介质体积的料液比，使团块状的生物组织样品转为均匀分散的生物组织料液，以确保沉积形成的模拟组织在组织形态、组织密度一致；(iv)细胞悬液的制备：采用细胞筛分、分级的方法制备的完整的离体细胞，并采用水性分散介质配制成一定浓度的细胞悬液；(v)组织料液与细胞悬液的混合：将组织料液与细胞悬液按一定比例充分混合；(vi)混合液的共沉积：准确吸取一定体积的组织料液与细胞悬液混合液，采取手动点样或自动化点样的方式，将混合液加载于贴有赋形膜材的载体底物上，使组织成分、细胞、目标分子在沉积的过程中完成塑形处理；(vii)模拟组织的固定成型：通过常温自然干燥、常温减压干燥或惰性干燥气流通干燥的方式，除去模拟生物组织中的水分，使模拟组织薄片与载体底物粘贴紧密。其中，所述模拟生物组织薄片，主要包括生物组织材料和组织细胞，并含有已知量的标准化合物分子。其中，(i)项中所述赋形膜材以低通透性的粘性薄膜作为膜材；赋形膜材的加工，采用机械切割或激光刻蚀方式实现。其中，(i)项中所述赋形膜材主要用于限定模拟组织样本的形态、尺寸及厚度，该赋形膜材尺寸可根据具体实验需要而准确刻制，单个样本呈规则矩形或正方形，或制作成多样本槽阵列模式。其中，(i)项中所述水性分散介质包括超纯水、等渗生理盐水、磷酸盐缓冲液、含天然高分子的水凝胶溶液，所述的天然高分子包括胶原蛋白或纤维蛋白。其中，(iii)项中所述组织料液的制备是将组织细胞与细胞间隙组织预先通过细胞筛分、分级方式进行物理分离，组织细胞经过纯化、富集，液氮冻存，待临用时重新分散至适宜浓度。其中，(iii)项所述的确定生物组织材料的质量和水性分散介质体积的料液比，是根据被模拟的实际组织切片的组织密度大小而进行优化调整的；根据被模拟的器官组织的不同，其组织匀浆浓度参考范围见表1所示。表1实际组织切片的组织密度与组织匀浆浓度参考范围注1：上述各器官组织的组织密度参考范围基于切片厚度在8～40μm内确定注2：组织匀浆的沉积体积为5μL，模型组织薄片面积为10mm2最优选的模拟生物组织薄片的制备方法包括如下步骤：(1)赋形膜材的加工以高分子聚合物粘性薄膜作为模拟生物组织薄片的赋形膜材，采用高精度数控机器通过机械切割或激光刻蚀方式加工赋形模板。进一步地，根据具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备模拟生物组织薄片的方法，主要包括以下步骤：(i)赋形膜材的加工：选取适宜高分子聚合物材料刻制塑形用模具，确定模拟生物组织的形状、尺寸以及样本布局；(ii)含化合物的水性分散介质的制备：向水性介质中加入适量已知浓度的标准化合物溶液，超声除去水性分散介质中的气泡，待用；(iii)组织料液的制备：将生物组织的分散处理，确定生物组织材料的质量和水性分散介质体积的料液比，使团块状的生物组织样品转为均匀分散的生物组织料液，以确保沉积形成的模拟组织在组织形态、组织密度一致；(iv)细胞悬液的制备：采用细胞筛分、分级的方法制备的完整的离体细胞，并采用水性分散介质配制成一定浓度的细胞悬液；(v)组织料液与细胞悬液的混合：将组织料液与细胞悬液按一定比例充分混合；(vi)混合液的共沉积：准确吸取一定体积的组织料液与细胞悬液混合液，采取手动点样或自动化点样的方式，将混合液加载于贴有赋形膜材的载体底物上，使组织成分、细胞、目标分子在沉积的过程中完成塑形处理；(vii)模拟组织的固定成型：通过常温自然干燥、常温减压干燥或惰性干燥气流通干燥的方式，除去模拟生物组织中的水分，使模拟组织薄片与载体底物粘贴紧密。...

【技术特征摘要】
2017.04.07 CN 20171022258891.一种制备模拟生物组织薄片的方法，主要包括以下步骤：(i)赋形膜材的加工：选取适宜高分子聚合物材料刻制塑形用模具，确定模拟生物组织的形状、尺寸以及样本布局；(ii)含化合物的水性分散介质的制备：向水性介质中加入适量已知浓度的标准化合物溶液，超声除去水性分散介质中的气泡，待用；(iii)组织料液的制备：将生物组织的分散处理，确定生物组织材料的质量和水性分散介质体积的料液比，使团块状的生物组织样品转为均匀分散的生物组织料液，以确保沉积形成的模拟组织在组织形态、组织密度一致；(iv)细胞悬液的制备：采用细胞筛分、分级的方法制备的完整的离体细胞，并采用水性分散介质配制成一定浓度的细胞悬液；(v)组织料液与细胞悬液的混合：将组织料液与细胞悬液按一定比例充分混合；(vi)混合液的共沉积：准确吸取一定体积的组织料液与细胞悬液混合液，采取手动点样或自动化点样的方式，将混合液加载于贴有赋形膜材的载体底物上，使组织成分、细胞、目标分子在沉积的过程中完成塑形处理；(vii)模拟组织的固定成型：通过常温自然干燥、常温减压干燥或惰性干燥气流通干燥的方式，除去模拟生物组织中的水分，使模拟组织薄片与载体底物粘贴紧密。2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，所述模拟生物组织薄片，主要包括生物组织材料和组织细胞，并含有已知量的标准化合物分子。3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，(i)项中所述赋形膜材以低通透性的粘性薄膜作为膜材；赋形膜材的加工，采用机械切割或激光刻蚀方式实现。4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，(i)项中所述赋形膜材主要用于限定模拟组织样本的形态、尺寸及厚度，该赋形膜材尺寸可根据具体实验需要而准确刻制，单个样本呈规则矩形或正方形，或制作成多样本槽阵列模式。5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，(i)项中所述水性分散介质包括超纯水、等渗生理盐水、磷酸盐缓冲液、含天然高分子的水凝胶溶液，所述的天然高分子包括胶原蛋白或纤维蛋白。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，(iii)项中是将组织细胞与细胞间隙组织预先通过细胞筛分、分级方式进行物理分离，组织细胞经过纯化、富集，液氮冻存，待临用时重新分散至适宜浓度。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过对生物组织材料的质量和水性分散介质体积的料液比的准确控制，可以实现模拟生物组织中组织密度与实际生物组织一致，进而使模拟组织的基质与实际组织相近。8.根据权利要求1-7任一项的制备方法制备得到的模拟生物组织薄片，其特征在于，所述的模拟生物组织薄片主要组成包括：确定添加量的标准化合物分子，来源于被模拟器官或组织的生物组织材料、组织细胞。9.根据权利要求8的模拟生物组织薄片，其特征在于，所述的标准化合物分子选自生物大分子，或生物内源性小分子代谢物，或外源性添加物；所述的生物大分子包括蛋白质、多肽、多糖，所述的生物内源性小分子代谢物包括脂类、氨基酸、脂肪酸、寡糖、单糖、核苷，所述的外源性添加物包括化学合成药物及其代谢产物、中药草天然产物。10.根据权利要求8所述的模拟生物组织薄片，其特征在于，所述的生物组织材料指来源于某脏器或组织，起到支撑、缓冲、保护作用的细胞间质成分，所述生物组织材料包括纤维蛋白、胶原蛋白、层黏蛋白。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：再帕尔阿不力孜，宋肖炜，贺玖明，厉欣，孙成龙，罗志刚，李铁钢，黄罗娇，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11