一种同时检测ONOO制造技术

本发明专利技术涉及荧光传感材料制备及生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测ONOO‑和H2S的荧光探针及其合成方法和应用。本发明专利技术探针分子具有两个反应位点：一个能够与H2S发生亲核加成反应(激发波长480nm，发射波长580nm)，导致荧光信号显著增强；另一个与ONOO

A simultaneous detection of ONOO

The invention relates to the preparation of fluorescent sensing materials and the technical field of biological detection, in particular to a fluorescent probe for simultaneous detection of ONOO_and H2S, and its synthesis method and application. The probe molecule of the invention has two reaction sites: one can react nucleophilically with H2S (excitation wavelength 480 nm, emission wavelength 580 nm), resulting in significant enhancement of fluorescence signal; the other can react with ONOO.

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测ONOO-和H2S的荧光探针及其合成方法和应用
本专利技术涉及荧光传感材料制备及生物检测
，具体涉及一种同时检测ONOO-和H2S的荧光探针及其合成方法和应用。
技术介绍
H2S作为体内重要的气体信号分子，参与了一系列的生理和病理过程。H2S浓度过高或者过低都可以引起疾病，适量的H2S具有降低血压、舒张血管和抑制血管平滑肌细胞增殖等多种生物学作用。H2S在高血压、冠心病以及缺血性心肌损等病理活动过程和后期治疗过程中都表现出重要作用。ONOO-是生物体内重要的活性氧分子，是由超氧阴离子(O2·-)和一氧化氮(NO)通过自由基反应生成的产物。ONOO-作为较强的氧化剂和亲核试剂，参与了生物体内广泛的生理和病理活动过程。一方面，ONOO-可以在机体的免疫系统中发挥辅助调节的作用。另一方面，ONOO-能够引起生物体内的酪氨酸硝基化，并且能氧化核酸、巯基分子和含有磷脂的不饱和脂肪酸等分子，导致细胞内线粒体功能紊乱以触发细胞死亡。因此，ONOO-与许多生物疾病如阿兹海默症、炎症、肝损伤以及癌症等密切关联。在生物体系中的H2S和ONOO-在细胞内的浓度很低、寿命非常短，一般的方法很难实现对其测定。但荧光探针由于具有灵敏度高、实时监测等优点，近年来已作为有力的手段用于高活性物种的检测与成像。
技术实现思路
本专利技术主要目的是，提供一种新型的同时检测ONOO-和H2S的分子荧光探针及其合成方法和应用。本专利技术荧光探针具有合成简单、灵敏度高、响应速度快的优点。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术目的之一，提供一种荧光探针，其结构式如下：本专利技术目的之二，提供所述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：将4-二乙氨基酮酸和3-乙酰基-6-溴香豆素溶解在的浓硫酸中，然后在80-95℃加热10-15h；冷却至室温，倒入冰水中，搅拌15-25min后过滤，冷水洗涤，真空干燥得粗品；将所得粗品用硅胶柱层析纯化，即得。优选的，4-二乙氨基酮酸和3-乙酰基-6-溴香豆素按照物质的量比1:1混合。优选的，在90℃加热12h。优选的，硅胶柱层析所用洗脱剂为二氯甲烷和甲醇。优选的，二氯甲烷和甲醇体积比为10:1。本专利技术目的之三，提供所述荧光探针在检测ONOO和/或H2S中的应用。本专利技术目的之四，提供所述荧光探针检测ONOO-和/或H2S的方法，将探针溶解在生理盐水、缓冲液或二甲亚砜水溶性有机溶剂中，然后加入缓冲液及ONOO-或H2S待测液进行混合，调节pH，进行检测，即得。优选的，所述缓冲液为PBS缓冲液。优选的，调节pH值为4.0-10.0。本专利技术探针在所述pH值范围内性质稳定。与现有技术相比，本专利技术的优点是：1.探针合成简单、灵敏度高、响应速度快。2.信噪比高：探针自身背景信号低，反应产物荧光信号强。3.该分子探针具有两个活泼的反应位点：一个能够与H2S发生亲核加成反应(激发波长480nm，发射波长580nm)，导致荧光信号显著增强；另一个与ONOO-发生亲核反应(激发波长400nm，发射波长520nm)，反应后荧光信号也显著增强。4.利用双激发双发射原理检测细胞内ONOO-和H2S。附图说明图1是本专利技术分子荧光探针对不同浓度的ONOO-的荧光响应光谱图；横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。探针的激发波长为400nm，发射波长为520nm。图2是本专利技术分子荧光探针对不同浓度的H2S的荧光响应光谱图；横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。探针的激发波长为480nm，发射波长为580nm。图3是本专利技术分子荧光探针分别与ONOO-和H2S的荧光响应光谱叠加图。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度，激发波长为400nm。图4是本专利技术分子荧光探针对ONOO-的选择性实验。横坐标为干扰物和待测物，纵坐标为荧光发射强度。探针的激发波长为400nm，发射波长为520nm。图5是本专利技术分子荧光探针对H2S的选择性实验。横坐标为干扰物和待测物，纵坐标为荧光发射强度。探针的激发波长为480nm，发射波长为580nm。图6是本专利技术分子荧光探针对ONOO-的反应动力学检测实验。横坐标为时间(s)，纵坐标为荧光发射强度。探针的激发波长为400nm，发射波长为520nm。图7是本专利技术分子荧光探针对H2S的反应动力学检测实验。横坐标为时间(s)，纵坐标为荧光发射强度。探针的激发波长为480nm，发射波长为580nm。图8是本专利技术分子荧光探针在不同pH环境下对ONOO-的荧光响应变化。横坐标为pH值，纵坐标为荧光发射强度。探针的激发波长为400nm，发射波长为520nm。图9是本专利技术分子荧光探针在不同pH环境下对H2S的荧光响应变化。横坐标为pH值，纵坐标为荧光发射强度。探针的激发波长为480nm，发射波长为580nm。图10是本专利技术分子荧光探针与ONOO-反应产物高分辨质谱验证。图11是本专利技术分子荧光探针与H2S反应产物高分辨质谱验证。图12是本专利技术分子荧光探针与外源性ONOO-在HepG2细胞中的荧光成像。(a)，(b)和(c)为细胞成像图，(d)为相对荧光强度。图13是本专利技术分子荧光探针与外源性H2S在HepG2细胞中的成像。(a)，(b)，(c)和(d)为细胞成像图，(e)为相对荧光强度。图14是本专利技术分子荧光探针在HepG2细胞内的TPM成像。(a)，(d)，(g)，(b)，(e)和(h)为细胞成像图。(c)，(f)和(i)为细胞亮场的叠加图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本专利技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本专利技术的技术方案。实施例：荧光探针的合成将4-二乙氨基酮酸(313.1mg，1.0mmol)和3-乙酰基-6-溴香豆素(266.0mg，1.0mmol)溶解在5.0mL的浓硫酸中，然后在90℃加热12h。冷却至室温，将溶液缓慢倒入50mL冰水中(紫色固体析出)，搅拌20min后过滤，冷水洗涤，真空干燥得粗品。进一步用硅胶柱层析(CH2Cl2/MeOH＝10:1，v/v)纯化，得到紫色固体化合物RC-Br(450.2mg，83％)。质谱及核磁表征：HRMS-ESI(m/z):calcdforC29H22BrNO5[M+H]+544.0754/546.0735；found544.0700/546.0678。1HNMR(400MHz,DMSO):δ8.84(s,1H),8.24(s,1H),7.95(d,J＝7.6Hz,1H),7.85(q,J＝6.4Hz,1H),7.80(t,J＝6.5Hz,1H),7.70(t,J＝7.4Hz,1H),7.46(d,J＝8.2Hz,1H),7.37(d,J＝6.0Hz,1H),6.60(s,1H),6.51本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光探针，其特征在于，其结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种荧光探针，其特征在于，其结构式如下：2.根据权利要求1所述荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：将4-二乙氨基酮酸和3-乙酰基-6-溴香豆素溶解在的浓硫酸中，然后在80-95℃加热10-15h；冷却至室温，倒入冰水中，搅拌15-25min后过滤，冷水洗涤，真空干燥得粗品；将所得粗品用硅胶柱层析纯化，即得。3.根据权利要求2所述荧光探针的合成方法，其特征在于，4-二乙氨基酮酸和3-乙酰基-6-溴香豆素按照物质的量比1:1混合。4.根据权利要求2所述荧光探针的合成方法，其特征在于，在90℃加热12h。5.根据权利要求2所述荧光探针的合成方法，其特征在于，硅胶柱层析所用洗脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐波，王栩，肖永胜，焦晓云，赵志文，解希雷，李娜，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37