微型双光子显微成像装置、小动物行为成像系统制造方法及图纸

本实用新型专利技术公开了一种微型双光子显微成像装置、小动物行为成像系统，所述微型双光子显微成像装置包括：飞秒脉冲激光器，其用于产生波长为920纳米的激光；飞秒脉冲激光调制器，其用于接收所述飞秒脉冲激光器输出的激光，并预啁啾补偿激光的脉冲展宽至预设值，并输出；微型探头，所述微型探头包括：扫描成像部分，用于接收所述飞秒脉冲激光调制器输出的激光，该激光对活体样本内部的组织进行扫描，以激发所述活体样本产生荧光信号；和荧光输出光纤，其用于接收所述扫描成像部分输出的所述荧光信号，并进行输出。所述微型双光子显微成像装置能够在自然生理环境中对自由活动的动物的树突和树突棘活动进行稳定的观测。

Minitype two photon microscopic imaging device and small animal behavior imaging system

The utility model discloses a miniature two-photon microscopic imaging device and a small animal behavior imaging system. The miniature two-photon microscopic imaging device comprises a femtosecond pulse laser, which is used to generate a laser with a wavelength of 920 nm, and a femtosecond pulse laser modulator which is used to receive an excitation from the femtosecond pulse laser. Light, and pre-chirp compensated laser pulse broadened to the preset value, and output; micro-probe, the micro-probe, including: scanning imaging section, for receiving the femtosecond pulse laser modulator output laser, the laser scans the tissue inside the living sample to excite the living sample to generate fluorescent signal And a fluorescent output fiber for receiving and outputting the fluorescent signal output by the scanning imaging section. The micro two-photon microscopic imaging device can stably observe the dendritic and dendritic spine activities of free-moving animals in natural physiological environment.

【技术实现步骤摘要】
微型双光子显微成像装置、小动物行为成像系统
本技术涉及光学成像
，特别是涉及一种微型双光子显微成像装置、小动物行为成像系统。
技术介绍
神经科学的最终目标之一是在自由活动的动物上了解亚细胞、细胞、环路和更高层次的神经元信息处理的基本原理。结合荧光指示剂，光学显微镜已经成为这一任务中的基本研究工具，因为它允许在多个时间和空间尺度上直接观测神经元活动。单个突触是信息传递，处理和存储的基本单位，对于理解脑功能和疾病机理至关重要。突触后结构--树突棘是亚微米结构，深埋在脑内，并以毫秒级的速度活动。由于其固有的光学切片和深层组织穿透能力，多光子显微镜一直是过去二十年内体内无创光学脑成像的首选技术。使用台式双光子显微镜(英文全称为“Two-PhotonMicroscopy”，下文均简称为“TPM”)，已能够在活体内观察到树突棘的形态变化，比如学习和记忆的神经元的活动。观察在清醒状态下活体样本头部复杂的树突棘活动可以通过配备有快速图像采集(采集频率大于15Hz)、高激发和光电探测效率的最先进的台式多光子显微镜实现。然而，活体样本的头部一直被固定，整个实验期间都处在物理约束和情绪压力下，而且没有先验证据表明神经元对外界的响应在虚拟现实和自由探索下是等价的。更重要的是，许多社会行为，比如亲子护理、交配和战斗，都不能用头部固定的实验来研究。为了应对这些挑战，一个理想的解决方案是开发能够长时间观察活体样本在自由活动过程中的树突棘的结构和功能动态的微型化显微镜。Denk和他的同事在2001年建立了基于光纤尖端扫描的第一个微型双光子显微镜(英文全称为“microTwo-PhotonMicroscopy”，下文均简称为“mTPM”)，然后接下来的十年里，其他许多课题组采取不同方法继续尝试。然而，这些mTPM没有一个被用于后续的生物应用，主要是由于两个主要的限制：第一，没人能够成像应用最广泛的荧光探针，如GCaMPs，原因是缺乏适当的光纤用来传输920纳米飞秒激光脉冲，以保证脉冲到样品没有失真。第二，mTPMs在体内实验中经常表现出低于它们的理论分辨率，原因可能是采样率低，微型渐变折射率(英文全称为“Graded-IndexLenses”，下文均简称为“GRIN”)透镜的像差，微型光学器件的缺陷和运动引起的成像噪声等等。目前，树突棘分辨率的神经元结构的活动不能被mTPMs很好的解决，尽管其理论横向分辨率为大约1μm。另一方面，微型单光子宽场显微镜，例如由Ghosh及其同事开发的显微镜，已经实现了快速采集和大视场(英文全称为“FieldofVision”，下文均简称为“FOV”)以及解决了运动引起的噪声问题(在神经元分辨率)。然而，当前的无创微型宽场显微镜仅能获得细胞分辨率，并且图像对比度受到累积的焦外背景信号的影响。到目前为止，可以提供很好的成像能力和实验方案，而且足够强大到可以满足神经科学家的日常实验的新型的mTPM仍有待完成。因此，希望有一种技术方案来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。
技术实现思路
本技术的目的在于提供一种微型双光子显微成像装置来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。为实现上述目的，本技术提供一种微型双光子显微成像装置，所述微型双光子显微成像装置包括：飞秒脉冲激光器，其用于产生波长为920纳米的激光；飞秒脉冲激光调制器，其用于接收所述飞秒脉冲激光器输出的激光，并预啁啾补偿激光的脉冲展宽至预设值，并输出；以及微型探头，所述微型探头集成在固定支架上，所述微型探头通过所述固定支架以可拆卸的方式能够安装在活体样本的头上；所述微型探头包括：扫描成像部分，用于接收所述飞秒脉冲激光调制器输出的激光，该激光对活体样本内部的组织进行扫描，以激发所述活体样本产生荧光信号；和荧光输出光纤，其用于接收所述扫描成像部分输出的所述荧光信号，并进行输出。本技术还提供一种活体样本行为成像系统，所述系统包括：微型双光子显微成像装置，其为如上所述的微型双光子显微成像装置；箱体，其为活体小动物的自由移动提供限定空间；数据收集组件，其安装在所述箱体上，且输入端通过荧光输出光纤连接所述微型探头的输出端，用于收集所述微型探头输出的所述荧光信号；线路安装组件，所述激光输入光纤和荧光输出光纤通过所述线路安装组件以能够相对于所述箱体随意转动的方式安装在所述箱体上。本技术提供的微型双光子显微成像装置(下文简称为“FIRM-TPM”)测试和应用的速度快、分辨率高，能够用于解决自由活动动物中单个树突棘的成像问题的整套实验方法。在涉及到不规则的、频繁的身体和头部运动的行为范例中(例如，尾悬挂，跳台，和社交行为)，本技术的微型显微镜都可以对GCaMP6f标记的的皮层神经元的体细胞，树突和树突棘进行观测。综合起来，FIRM-TPM代表了下一代微型显微镜，它满足在自由活动动物中进行高分辨率脑成像的需求。附图说明图1是本技术所提供的FIRM-TPM一优选实施方式的结构示意图。图2是图1中的微型探头安装在小老鼠上的状态示意图。图3是图1中的微型探头的光路原理示意图。图4是本技术所提供的飞秒脉冲激光调制器一优选实施方式的结构示意图。图5a是本技术利用图1的微型双光子显微成像装置的活体样本行为成像系统的结构示意图。图5b是图5a中的数据收集组件和线路安装组件的分解示意图。图6是台式TPM、微型宽场荧光显微镜和FIRM-TPM各项性能的集成平台在台式双光子模式下的光路示意图，该图示意出了台式TPM的结构示意图。图7是图6的集成平台在宽场成像模式下的光路示意图。图8是图6的集成平台在FIRM-TPM成像模式下的光路示意图，该图示意出了在图6的台式TPM中的物镜与物面(活体样本或活体样本)之间的光路上设置有图1的FIRM-TPM。图9a-1是使用800nm激发波长下在V-1皮质中表达GCaMP-6f的AAV转染活体样本中成像相同组的神经元胞体cell1、cell2和cell3获得的荧光图像。图9a-2是使用920nm激发波长下在V-1皮质中表达GCaMP-6f的AAV转染活体样本中成像相同组的神经元胞体cell1、cell2和cell3获得的荧光图像。图9a-3是使用1030nm激发波长下在V-1皮质中表达GCaMP-6f的AAV转染活体样本中成像相同组的神经元胞体cell1、cell2和cell3获得的荧光图像。图9b是10个胶质细胞的Ca2+信号的神经元胞体的频率。图9c-1是10个胶质细胞的Ca2+信号的神经元胞体的幅度。图9c-2是10个胶质细胞的Ca2+信号的神经元胞体的平均时程。图9d-1是在不同的焦平面成像神经元树突dendrite1、dendrite2和dendrite3使用800nm激光获得的荧光图像。图9d-2是在不同的焦平面成像神经元树突dendrite1、dendrite2和dendrite3使用920nm激光获得的荧光图像。图9d-3是在不同的焦平面成像神经元树突dendrite1、dendrite2和dendrite3使用1030nm激光获得的荧光图像。图9e是来自图9d中所示的十个树突Ca2+信号的频率。图9f-1是来自图9d中所示的十个树突Ca2+信号的平均时程。图9f-2是来自本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微型双光子显微成像装置，其特征在于，包括：飞秒脉冲激光器，其用于产生波长为920纳米的激光；飞秒脉冲激光调制器，其用于接收所述飞秒脉冲激光器输出的激光，并预啁啾补偿激光的脉冲展宽至预设值，并输出；以及微型探头，所述微型探头集成在固定支架上，所述微型探头通过所述固定支架以可拆卸的方式能够安装在活体样本的头上；所述微型探头包括：扫描成像部分，用于接收所述飞秒脉冲激光调制器输出的激光，该激光对活体样本内部的组织进行扫描，以激发所述活体样本产生荧光信号；和荧光输出光纤，其用于接收所述扫描成像部分输出的所述荧光信号，并进行输出。

【技术特征摘要】
2017.02.10 CN 20172012345851.一种微型双光子显微成像装置，其特征在于，包括：飞秒脉冲激光器，其用于产生波长为920纳米的激光；飞秒脉冲激光调制器，其用于接收所述飞秒脉冲激光器输出的激光，并预啁啾补偿激光的脉冲展宽至预设值，并输出；以及微型探头，所述微型探头集成在固定支架上，所述微型探头通过所述固定支架以可拆卸的方式能够安装在活体样本的头上；所述微型探头包括：扫描成像部分，用于接收所述飞秒脉冲激光调制器输出的激光，该激光对活体样本内部的组织进行扫描，以激发所述活体样本产生荧光信号；和荧光输出光纤，其用于接收所述扫描成像部分输出的所述荧光信号，并进行输出。2.如权利要求1所述的微型双光子显微成像装置，其特征在于，所述飞秒脉冲激光调制器具有负色散光路和正色散光路，其中：所述负色散光路包括激光输入光纤，所述激光输入光纤用于将脉冲展宽预啁啾补偿好的激光传输给所述扫描成像部；所述正色散光路，其位于所述飞秒脉冲激光器和所述负色散光路之间，用于补偿由所述激光输入光纤在传输激光过程中引起的负色散。3.如权利要求2所述的微型双光子显微成像装置，其特征在于，所述正色散光路包括：色散补偿元件,其临近所述飞秒脉冲激光器设置，用于补偿由所述激光输入光纤在传输激光过程中引起的负色散；和声光调制器，其用于接收经由所述补偿元件补偿后的激光，并调节激光强度，然后输出给所述扫描成像部分。4.如权利要求3所述的微型双光子显微成像装置，其特征在于，所述正色散光路还包括：激光方位调整组件，其设置在所述色散补偿元件与所述声光调制器之间，所述激光方位调整组件包括：第一半波片，用于接收经由所述补偿元件补偿后的激光，并调整激光偏振方向，以使得所述声光调制器的调制效率最高；第一反射镜，用于接收经由所述第一半波片的激光，并反射激光，以调整激光射入所述声光调制器的位置；和第二反射镜，用于接收经由所述第一反射镜的激光，并反射激光，以调整激光射入所述声光调制器的角度，并传输给所述声光调制器。5.如权利要求3所述的微型双光子显微成像装置，其特征在于，所述正色散光路还包括：分光组件，其临近所述激光输入光纤设置，用于接收经由所述声光调制器调节好强度的激光以及将该激光分成至少两束，并传输给所述激光输入光纤。6.如权利要求5所述的微型双光子显微成像装置，其特征在于，所述激光输入光纤的数量至少为两根，分别为第一激光输入光纤和第二激光输入光纤；所述分光组件包括：偏振分束器，用于接收经由所述声光调制器调节好强度的激光以及将该激光分成至少两束，分别传输给所述第一激光输入光纤和第二激光输入光纤；第二半波片，其布置在所述偏振分束器...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗伟健，陈良怡，程和平，吴润龙，李明立，张云峰，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：新型
国别省市：北京,11