用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法技术

本发明专利技术涉及分子诊断技术领域，具体公开一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法。所述引物和探针序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，其能特异性检测猪流行性腹泻病毒的野毒株。本发明专利技术TaqMan实时荧光定量PCR方法利用所述引物和探针对样品进行扩增，若Cq≤36，则判定为阳性，即样品为猪流行性腹泻病毒的野毒株。该方法特异性强，敏感性高，重复性好，临床检出率高，为PED的快速检测与防治提供重要技术手段。

* primers and probes for detection of wild viruses of porcine epidemic diarrhea virus and TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR method

The invention relates to the field of molecular diagnosis technology, * specifically discloses a primer and probe for detecting porcine epidemic diarrhea virus wild strain, and a TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR method. The sequences of primers and probes, such as SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 and SEQ ID NO:3 *, show that they can specifically detect the wild strain of porcine epidemic diarrhea virus. The TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR method is used to amplify the samples by using the primers and probes. If Cq is less than 36, it is positive * that is, the wild strain of porcine epidemic diarrhea virus. This method has strong specificity, high sensitivity, good repeatability and high clinical detection rate, which provides an important technical means for rapid detection and prevention of PED.

【技术实现步骤摘要】
用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法
本专利技术涉及分子诊断
，具体涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法。
技术介绍
猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，PED)是由冠状病毒科、冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(PEDvirus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，主要危害7～10日龄仔猪，引起腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。该病冬季多发，但近年来发病季节性不明显，一年四季均有发生。该病首先在英国暴发，而后遍及全球，我国于1976年首次对PED进行报道。2010年以来，PED在亚洲尤其是中国的流行相当严重，首先在我国华南地区暴发，随后遍及全国大部分省的猪场。此次PED暴发是由PEDV的变异株引起的，其临床症状、发病率和死亡率均比以前的PED严重。主要表现为流行范围广、初生仔猪发病率和死亡率高。疫苗免疫是当前防控PED的重要措施，以CV777减毒株为代表的活疫苗临床应用普遍，导致常规实验室诊断方法不能快速区分野毒株与疫苗株。ORF3基因是PEDV的辅助基因，其部分片段的缺失可导致PEDV毒力减弱，是鉴别PEDV野毒株和疫苗弱毒株的重要靶标。PED的诊断方法有病原学、血清学和分子生物学等多种方法。实时荧光定量PCR技术是由常规PCR技术衍生而来的一种新的高特异性的核酸定量技术，并能够对目的核酸的扩增情况进行实时监测，该技术在病原检测和传染病诊断方面已得到广泛应用。但目前尚未见有根据PEDV野毒株和疫苗毒株ORF3基因序列的差异，鉴别检测PEDV野毒株实时荧光定量PCR技术的报道。
技术实现思路
针对以上技术现状，本专利技术提供一种基于ORF3基因序列的用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法(TaqManFQ-PCR)。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针，其序列如下：F引物：CGTTTTGCTGTCATTGTTCTT(SEQIDNO:1)；R引物：AGACTAAACAAAGCCTGCCAATA(SEQIDNO:2)；TaqMan探针：ATTGCCCACTTTTATATTATTGTGGTGCATTTTTAGATG(SEQIDNO:3)。所述TaqMan探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。引物和探针的设计和筛选对TaqManFQ-PCR方法的成功与否非常重要。本专利技术定位于PEDV的保守基因ORF3内部，根据强弱毒株的ORF3基因差异序列设计引物及探针，这样在鉴别PEDV疫苗株和野毒株的前提下保证了TaqManFQ-PCR方法的准确性和可靠性。本专利技术还提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的试剂盒，其包含上述引物和探针。优选地，所述试剂盒中还包含猪流行性腹泻病毒野毒株阳性参考品，所述阳性参考品为含有猪流行性腹泻病毒疫苗株RNA和野毒株RNA的质粒。本专利技术还提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品总RNA；(2)对待检样品总RNA进行逆转录得cDNA；(3)将上述引物和探针加入实时荧光定量PCR反应体系中，以逆转录获取的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增；(4)根据扩增结果进行判定，若Cq≤36，则判定为阳性，即待检样品中含有猪流行性腹泻病毒的野毒株；若Cq＞36，则判定为阴性，即待检样品中不含猪流行性腹泻病毒的野毒株。优选地，所述PCR反应体系中F引物、R引物和TaqMan探针的浓度均为250nM。优选地，所述PCR扩增的条件为：95℃30S进行预变性，共1个循环；95℃反应5s，55℃反应30s，共45个循环；55℃时，采集荧光信号。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术基于PEDVORF3设计的引物和探针可特异性鉴别检测猪流行性腹泻病毒的野毒株，对PEDV弱毒疫苗免疫后仍暴发PEDV野毒感染的研究具有临床意义，为PED的流行病学调查及遗传变异分析提供技术支持。本专利技术建立的用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有以下优点：(1)特异性强，当扩增的Cq值小于等于36个循环时，能特异性检测猪流行性腹泻病毒野毒株，与PEDV弱毒疫苗株(CV777)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和轮状病毒(RV)等无交叉反应。(2)敏感性高，即使模板量很低，也可被检测到，最少可检测到7.96个TCID50，可检测到的最低拷贝数为3.7拷贝，比SYBRGreenⅠFQ-PCR方法和常规RT-PCR方法敏感10倍。(3)重复性好，本专利技术则通过对特异性的批间重复试验进行分析，其变异系数值均在2.46％以内，小于10％，说明该方法稳定可靠，可以在临床推广应用。(4)临床检出率高，与间接免疫荧光法相比，本专利技术方法检出率高20％左右，两种方法总符合率94.74％，阳性符合率83.33％，阴性符合率92.86％。附图说明图1A是本专利技术实施例中CV777与QY毒株ORF3基因的RT-PCR扩增图谱；其中三个条带分别为：1:100bpDNALadder；2:QYF4RT-PCR扩增产物；3:CV777RT-PCR扩增产物。图1B为本专利技术实施例中CV777与QY重组质粒RT-PCR鉴定图谱；其中三个条带分别为：1:100bpDNALadder；2:pET-28a-QY-ORF3重组质粒PCR鉴定；3:pET-28a-CV777-ORF3重组质粒PCR鉴定。图2是本专利技术实施例中PEDV-ORF3基因重组质粒的酶切鉴定图谱；其中，1、DL10000DNAmarker；2、pET-28a-QY-ORF3菌液PCR扩增产物；3、pET-28a-CV777-ORF3菌液PCR扩增产物；4、pET-28a-QY-ORF3质粒酶切；5、pET-28a-CV777-ORF3质粒酶切；6、pET-28a质粒酶切；7、pET-28a菌液PCR。图3为本专利技术实施例中不同浓度的QY的FQ-PCR扩增曲线，由左至右浓度依次为：102拷贝/μL、103拷贝/μL、104拷贝/μL、105拷贝/μL、106拷贝/μL、107拷贝/μL、108拷贝/μL、109拷贝/μL。图4为本专利技术实施例中QY的FQ-PCR的浓度与Cq值的标准曲线。图5为本专利技术实施例中不同病毒的扩增曲线，A：pET-28a-QY-ORF3；B：PEDV-QY；C：PRV、PCV2、RV、TGEV；D：PEDV-CV777、CSFV、PRRSV、PPV、阴性对照。图6为本专利技术实施例中敏感性检测试验结果。图7为本专利技术TaqMan实时荧光定量PCR方法与SYBRGreenⅠFQ-PCR方法的敏感性比较结果。图8为常规PCR方法的敏感性结果，其中，1:100bpDNALadder；2～9依次为:阳性质粒依次做10-4～10-11倍稀释，其内分别含有3.7×106、3.7×105、3.7×104、3.7×103、3.7×102、3.7×101、3.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针，其特征在于：F引物：序列如SEQ ID NO:1所示；R引物：序列如SEQ ID NO:2所示；TaqMan探针：序列如SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针，其特征在于：F引物：序列如SEQIDNO:1所示；R引物：序列如SEQIDNO:2所示；TaqMan探针：序列如SEQIDNO:3所示。2.如权利要求1所述的用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针，其特征在于：所述TaqMan探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。3.一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1或2所述的引物和探针。4.如权利要求3所述的用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的试剂盒，其特征在于：还包含猪流行性腹泻病毒野毒株阳性参考品，所述阳性参考品为含有猪流行性腹泻病毒野毒株RNA的质粒。5.一种用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋勤叶，刘京，李丽敏，郭海勇，陈立功，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北,13