本发明专利技术公开了一组用于1型糖尿病诊断的标志物，由hsa‑miR‑642a‑3p、hsa‑miR‑320c和hsa‑miR‑1225‑5p这3种miRNA组成；本发明专利技术还公开了所述的标志物在制备1型糖尿病诊断试剂盒中的应用，试剂盒中含有定量hsa‑miR‑642a‑3p、hsa‑miR‑320c、hsa‑miR‑1225‑5p表达量的试剂。本发明专利技术利用统计学方法，联合多个血清miRNA及临床人口学资料建立1型糖尿病血清miRNA辅助诊断模型，较既往已知单个生物标志物具有更好的诊断支持效能。本发明专利技术利用患者循环中miRNA，其表达稳定，易于储存及检测，便于临床应用。
A group of markers for type 1 diabetes mellitus and its application
The present invention discloses a set of markers for the diagnosis of type 1 diabetes mellitus, which are composed of three kinds of microRNAs: hsa_microRNA 3p, hsa_microRNA 320C and hsa_microRNA 5 5;5p. The application of the markers in the preparation of a diagnostic kit for type 1 diabetes mellitus also discloses the application of the markers in the preparation of the kit which contains quantitative hsa_microRNA 2A 3p, hsa_mi_3;3;3p. Reagent R, 320C, HSA miR miR 1225 5p expression. The invention uses statistical method, combines multiple serum microRNAs and clinical demographic data to establish an auxiliary diagnostic model of serum microRNAs in type 1 diabetes mellitus, and has better diagnostic support efficiency than a single known biomarker. The invention utilizes the circulating microRNAs of patients, and has stable expression, easy storage and detection, and is convenient for clinical application.
【技术实现步骤摘要】
一组1型糖尿病标志物及其应用
本专利技术涉及1型糖尿病诊断
，尤其是一组1型糖尿病标志物及其应用。
技术介绍
目前1型糖尿病尚缺乏有效的疾病标志物，早期的筛查与治疗面临巨大挑战。迫切需要寻找新的疾病标志物以提高诊疗效能。随着微小RNA(microRNA,miRNA)研究的不断深入，其作为新型无创性分子标志物的潜能越来越受到人们的关注。成熟的miRNA是一类由21～23个核苷酸组成的内源性小分子单链非编码RNA，通过与靶mRNA碱基结合，影响mRNA的翻译或稳定性，对基因进行转录后水平的调控。目前已经确认人类基因组可以编码2000余种成熟的miRNA，调节人类近三分之一的基因表达。miRNA的表达具有高度的保守型、时序性及组织特异性，参与调控各种重要的生理及病理过程，miRNA的调节一旦失衡，会导致细胞功能紊乱及疾病的产生。近年来，研究发现miRNA可能通过囊泡、脂蛋白等载体的协助游离至细胞外，广泛存在于血清、血浆、尿液、唾液等体液中，成为循环miRNA。其在体液中具有良好的稳定性，可以抵御血液RNA酶的破坏，即使在高温、强酸强碱、反复冻融、长期储存等情况下仍能保持稳定，且qRT-PCR技术检测敏感性高。健康男女miRNA表达谱无差异，而不同的疾病有各自独特的miRNA表达谱。这些特性为其可能作为潜在的疾病分子标志物奠定了良好的基础，已在多种肿瘤和非肿瘤疾病的诊断和预后中显示了独特的价值。目前临床上常用C肽及胰岛自身抗体如谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、锌转运体8抗体(ZnT8A)、胰岛细胞抗体(ICA)等来评估胰岛细胞破坏程度及1型糖尿病的患病风险，但是以此作为疾病的标志物仍存在许多局限性，例如，C肽在胰岛破坏晚期才能反映疾病的特性且缺乏特异性；胰岛自身抗体往往是陆续出现的，时间间隔数月甚至上十年，并非所有患者在诊断时抗体呈阳性，并且许多自身抗体阳性的易感者并不一定发生1型糖尿病等；这些基于蛋白分子的检测在临床常规中检测繁琐、费用昂贵且耗时，应用前景不容乐观。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一组敏感性高、特异性高的1型糖尿病诊断的标志物。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括以下几个方面：在一个方面，本专利技术提供了一组用于1型糖尿病诊断的标志物，所述标志物由hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c和hsa-miR-1225-5p组成。其中，hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-1225-5p指3种microRNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示。优选地，所述诊断采用公式：logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI，式中，2-△Ct为该miRNA的相对(内参，例如非编码的U6小核RNA)表达量，BMI为身体质量指数；需要说明的是，根据所述公式，可以界定很多阈值，不同的阈值，具有不同的诊断效能；医生在应用时，可以根据临床情况进行相应的调整；例如，P值大于0.5时，定义为高风险，反之，则为低风险。应当说明的是，采用所述公式可以评估患者患有1型糖尿病的风险高低，但是，并不能确诊该患者是否患有1型糖尿病，还需要通过传统的生化检测以确定患者是否患有1型糖尿病，例如，检测血糖浓度。在另一个方面，本专利技术提供了上述的标志物在制备1型糖尿病诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒中含有定量hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c和hsa-miR-1225-5p表达量的试剂。其中，定量hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c和hsa-miR-1225-5p表达量的试剂包括但不限于，例如，hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-1225-5p的荧光定量PCR所用到的相关试剂，比如，相应的逆转录引物，以及逆转录所得cDNA的检测引物等；需要说明的是，逆转录引物和检测引物(其碱基序列不是唯一的，只要能实现逆转录，以及扩增出目的cDNA序列即可)均可交由引物合成公司设计与合成，只要将相应的microRNA的核苷酸序列提交给引物合成公司即可，该流程已经成为成熟的商业化行为。优选地，所述诊断采用公式：logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI，式中，2-△Ct为该miRNA的相对(内参，例如非编码的U6小核RNA)表达量，BMI为身体质量指数；其中，年龄为患者的实际年龄。在第三个方面，本专利技术提供一种用于辅助1型糖尿病诊断的方法，包括如下步骤：(1)检测患者miR-320c和miR-1225-5p表达量；例如，采用逆转录PCR和荧光定量PCR相结合检测；(2)将上述表达量代入公式：logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI，计算得出P值，然后根据P值的大小判断患者患有1型糖尿病风险的高低，其中，2-△Ct为该miRNA的相对(内参，例如非编码的U6小核RNA)表达量，BMI为身体质量指数，年龄指患者的实际年龄。综上所述，本专利技术的有益效果为：1、本专利技术利用统计学方法，筛选出多个血清miRNA作为1型糖尿病诊断的分子标志物，再结合临床人口学资料建立1型糖尿病血清miRNA诊断的辅助模型，较既往已知单个生物标志物如C肽、胰岛自身抗体等具有更好的诊断支持效能，并弥补了以往诊断标志物敏感性及特异性欠佳的缺陷；2、本专利技术利用患者循环中miRNA，其表达稳定，易于储存及检测，便于临床应用，弥补了以往基于蛋白分子的检测在临床常规中检测繁琐、费用昂贵且耗时的缺陷。附图说明图1为本专利技术实施例1～3的试验方法的流程示意图；其中，T1DM表示1型糖尿病，microarrays表示微阵列芯片，miRNA表示微小RNA，QPCR表示实时定量核酸扩增检测，ROC表示受试者工作特征曲线，AUC表示受试者工作特征曲线下面积；图2为T1DM组与健康对照组6条血清miRNAs在训练队列相对表达水平比较图，其中，利用qRT-PCR技术检测6条miRNAs在血清中的相对表达水平，6条miRNAs的相对表达量(即靶miRNA表达量/内参照表达量，内参照为非编码的U6小核RNA，常用来作为PCR内参)均采用2-△Ct表示；对照表示健康对照组，T1DM表示1型糖尿病组；图3为miRNA诊断辅助模型对T1DM的诊断ROC曲线(训练队列)；图4为miRNA诊断模型对T1DM的诊断ROC曲线(验证队列)。具体实施方式本专利技术探讨了中国1型糖尿病患者血清循环miRNA表达情况，并经大样本临床验证，分析其中部分miRNA作为1型糖尿病生物标志物的效能(具有较高敏感性及特异性)，并建立1型糖尿病诊断辅助模型(具体过程的示意图参见图1)。本专利技术涉及1型糖尿病患者血清miRNA表达谱，以及诊断支持或辅助模型，涉及血清miRNA生物标志物效能，属于医学诊断支持
本专利技术中提供了可用于辅本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组用于1型糖尿病诊断的标志物，其特征在于，所述标志物由hsa‑miR‑642a‑3p、hsa‑miR‑320c和hsa‑miR‑1225‑5p组成。
【技术特征摘要】
1.一组用于1型糖尿病诊断的标志物，其特征在于，所述标志物由hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c和hsa-miR-1225-5p组成。2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述诊断采用公式：logit(P)＝0.613+0.174×miR-320c(2-△Ct)-2.199×miR-1225-5p(2-△Ct)+0.09×年龄-0.213×BMI，式中，2-△Ct为该miRNA的相对表达量，BMI为身体质量指数。3.权利要求1所述的标志物在制备1型糖尿病诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒中含有定量hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-320c和hsa-miR-1225-5p表达量的试剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断采用...
【专利技术属性】
技术研发人员：翁建平，刘莉，严晋华，梁华，
申请(专利权)人：中山大学附属第三医院中山大学肝脏病医院，
类型：发明
国别省市：广东,44
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