检测ATP7B基因突变的检测体系及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种检测ATP7B基因突变的检测体系及其试剂盒，包括数字PCR预混液和引物探针混合液；引物探针混合液包括用于检测第8号外显子c.2333 G>T位点的上下游引物A和肽核酸探针A，用于检测第13号外显子c.2975 C>T位点的上下游引物B和肽核酸探针B；所述肽核酸探针A的核苷酸序列与ATP7B基因c.2333突变型位点完全互补，所述肽核酸探针B的核苷酸序列与ATP7B基因c.2975突变型位点完全互补；所述肽核酸探针的5’端连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团。本发明专利技术的检测ATP7B基因突变的检测体系及其试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行PCR定量检测。

Detection system and kit for detecting ATP7B gene mutation

The invention relates to a detection system for ATP7B gene mutation and a kit thereof, comprising a digital PCR premix and a primer probe mixture; the primer probe mixture comprises an upstream and downstream primer A and a peptide nucleic acid probe A for detecting exon 8 c.2333 G > T site, and an upstream and downstream primer A and a peptide nucleic acid probe A for detecting exon 13 c.2975 C > T site. Primer B and peptide nucleic acid probe B; the nucleotide sequence of the peptide nucleic acid probe A is completely complementary to the c.2333 mutation site of the ATP7B gene; the nucleotide sequence of the peptide nucleic acid probe B is completely complementary to the c.2975 mutation site of the ATP7B gene; the 5'end of the peptide nucleic acid probe is connected with a strong chelating group composed of four amino acids. The detection system for detecting mutation of ATP7B gene and its kit have high sensitivity and specificity, and the sample demand is small, so the PCR quantitative detection can be carried out quickly, conveniently and accurately.

【技术实现步骤摘要】
检测ATP7B基因突变的检测体系及其试剂盒
本专利技术涉及一种检测ATP7B基因突变的检测产品，属于生物

技术介绍
Wilson病(WD)，亦称肝豆状病变，是一种与铜代谢障碍相关的常染色体隐性遗传病。WD起病时通常有一段无症状期，期间铜在肝脏中积累，从而导致亚临床肝炎和神经精神症状的发展。ATP7B基因是目前唯一已知的WD相关基因，ATP7B基因全长约80kb，含22个外显子。ATP7B是一个膜相关的金属转运ATP酶，能利用ATP提供的能量使天冬氨酸残基磷酸化的同时实现铜离子转运，参与铜跨膜转运过程。其生理功能是使铜离子活化、使金属铜结合到铜蓝蛋白中，维持正常铜代谢。当前已报道的ATP7B基因突变已有500余种。对我国WD患者的研究表明，发生在8、12、13和16外显子的基因突变占70％以上。其中8号外显子Arg778Leu突变频率高达46.15％，证实了在我国Arg778Leu是基因突变热点，而13号外显子Pro992Leu突变占15.38％，突变频率位居第二。外周血细胞游离DNA是来自正常细胞和肿瘤细胞死亡后释放的核酸片段总称。由于其再体内的半衰期较短且细胞释放的核酸会进入外周血，因此cfDNA较之于组织标本更能实时全面地反映患者体内的肿瘤情况。使用灵敏度较低的常规方法检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤变异，采用高灵敏度法(如dPCR)检测则可以发现较高比例的携带突变型患者。多重数字PCR由于灵敏度等方面的优势，通过单分子扩增把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来，可用于疾病或病毒的早期诊断或疗效监测。与常规的ARMs方法相比，多重数字PCR在检测血浆cfDNA时灵敏度明显优于ARMs法。PNA(peptidenucleicacid)中文名称肽核酸，是一种全新的人工合成DNA类似物，它与DNA分子的差异在于戊糖磷酸二酯键骨架被中性肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代，其他结构与DNA一致。基于PNA的多重数字PCR技术主要依赖PNA探针的两个重要特性：第一，PNA只能与完全配对的互补DNA链杂交，只要有单一碱基发生错配，PNA就不能与互补的DNA链结合；第二，PNA寡聚体不能被DNA聚合酶识别，从而不会成为PCR扩增的引物。相反，它作为特定序列选择工具，可以阻止想应的PCR扩增。一旦模板中的目的基因发生突变并因此出现错配，DNA/PNA双链结合松动，DNA寡聚体模板链就可以正常延伸，作为PCR引物，使发生突变的样本在多重数字PCR中得到阳性扩增产物，而野生型基因则不会扩增。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种包含由强螯合基团修饰的肽核酸探针，灵敏度和特异性高，模板DNA需求量少，可以快速便捷地进行精准定量PCR检测的ATP7B基因突变检测检测体系及其试剂盒。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种检测ATP7B基因突变的检测体系，包括数字PCR预混液和引物探针混合液；所述引物探针混合液包括用于检测第8号外显子c.2333G>T位点的上下游引物A和肽核酸探针A，以及用于检测第13号外显子c.2975C>T位点的上下游引物B和肽核酸探针B；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述肽核酸探针A的核苷酸序列与ATP7B基因c.2333突变型位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述肽核酸探针B的核苷酸序列与ATP7B基因c.2975突变型位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述肽核酸探针A和肽核酸探针B核苷酸序列的5’端均连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团，4个氨基酸从5’至3’端依次为谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸，或者为天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸。所述数字PCR预混液中包括BSA、DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、液滴稳定剂和缓冲液。所述肽核酸探针A和肽核酸探针B的5’端设有报告荧光基团FAM，所述肽核酸探针A和肽核酸探针B的3’端设有淬灭荧光基团BHQ。所述上下游引物A和上下游引物B在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸探针A和肽核酸探针B在反应体系中的最终浓度为0.18～0.25μM/L。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种采用上述检测体系的检测ATP7B基因突变检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种检测ATP7B基因突变的试剂盒，包括数字PCR预混液、引物探针混合液、阳性质控和阴性质控；所述引物探针混合液包括用于检测第8号外显子c.2333G>T位点的上下游引物A和肽核酸探针A，以及用于检测第13号外显子c.2975C>T位点的上下游引物B和肽核酸探针B；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述肽核酸探针A的核苷酸序列与ATP7B基因c.2333突变型位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述肽核酸探针B的核苷酸序列与ATP7B基因c.2975突变型位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述肽核酸探针A和肽核酸探针B核苷酸序列的5’端均连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团，4个氨基酸从5’至3’端依次为谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸，或者为天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸。所述数字PCR预混液包括BSA、DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、液滴稳定剂和缓冲液；所述阳性质控是含突变型ATP7B基因标准质粒溶液；所述阴性质控是含野生型ATP7B基因标准质粒溶液。所述上下游引物A和上下游引物B在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸探针A和肽核酸探针B在反应体系中的最终浓度为0.18～0.25μM/L；所述肽核酸探针A和肽核酸探针B的5’端设有报告荧光基团FAM，所述肽核酸探针的3’端设有淬灭荧光基团BHQ。所述上下游引物A和上下游引物B在反应体系中的最终浓度为0.19μM/L；所述肽核酸探针A和肽核酸探针B在反应体系中的最终浓度分别为0.21μM/L。所述数字PCR预混液包括浓度为5％的BSA、浓度为1U/μL的热启动Taq酶和UDG酶、浓度为4mM的MgCl2、浓度为50mM的pH值为8.3的Tris-HCl、浓度为300mM的dNTP、浓度为1.6μL/反应的液滴稳定剂。反应时，40体积的反应体系包括数字PCR预混液10体积，引物探针混合液10体积，模板1体积，灭菌超纯水19体积，所述模板的使用浓度为10ng/μL～100ng/μL。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是一种精准定量检测ATP7B基因突变的检测方法，采用上述精准定量检测ATP7B基因突变的试剂盒进行检测，具体检测方法包括如下步骤：(1)提取样本DNA：外周血全血1900×g离心后吸取血浆，16000×g再次离心，吸取上清液，使用QIAmpCircu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测ATP7B基因突变的检测体系，其特征在于：包括数字PCR预混液和引物探针混合液；所述引物探针混合液包括用于检测第8号外显子c.2333 G>T位点的上下游引物A和肽核酸探针A，以及用于检测第13号外显子c.2975 C>T位点的上下游引物B和肽核酸探针B；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述肽核酸探针A的核苷酸序列与ATP7B基因c.2333突变型位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述上游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述肽核酸探针B的核苷酸序列与ATP7B基因c.2975 突变型位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述肽核酸探针A和肽核酸探针B核苷酸序列的5’端均连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团，4个氨基酸从5’至3’端依次为谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸，或者为天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种检测ATP7B基因突变的检测体系，其特征在于：包括数字PCR预混液和引物探针混合液；所述引物探针混合液包括用于检测第8号外显子c.2333G>T位点的上下游引物A和肽核酸探针A，以及用于检测第13号外显子c.2975C>T位点的上下游引物B和肽核酸探针B；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述肽核酸探针A的核苷酸序列与ATP7B基因c.2333突变型位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述上游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述下游引物B的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述肽核酸探针B的核苷酸序列与ATP7B基因c.2975突变型位点完全互补且核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；所述肽核酸探针A和肽核酸探针B核苷酸序列的5’端均连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团，4个氨基酸从5’至3’端依次为谷氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸，或者为天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸。2.根据权利要求1所述的检测ATP7B基因突变的检测体系，其特征在于：所述数字PCR预混液中包括BSA、DNA聚合酶、超纯水、dNTPs混合液、液滴稳定剂和缓冲液。3.根据权利要求1所述的检测ATP7B基因突变的检测体系，其特征在于：所述肽核酸探针A和肽核酸探针B的5’端设有报告荧光基团FAM，所述肽核酸探针A和肽核酸探针B的3’端设有淬灭荧光基团BHQ。4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测ATP7B基因突变的检测体系，其特征在于：所述上下游引物A和上下游引物B在反应体系中的最终浓度均为0.1～0.3μM/L；所述肽核酸探针A和肽核酸探针B在反应体系中的最终浓度为0.18～0.25μM/L。5.一种采用如权利要求1所述的检测体系的检测ATP7B基因突变检测产品。6.一种检测ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于：包括数字PCR预混液、引物探针混合液、阳性质控和阴性质控；所述引物探针混合液包括用于检测第8号外显子c.2333G>T位点的上下游引物A和肽核酸探针A，以及用于检测第13号外显子c.2975C>T位点的上下游引物B和肽核酸探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明，赵国玲，洪专，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31