一种巨大芽孢杆菌BM22及其液体制剂的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种巨大芽孢杆菌BM22及其液体制剂的制备和应用，该菌株已经于2017年12月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15070。以巨大芽孢杆菌BM22为菌种，经种子培养、发酵培养可制备得到液体制剂。本发明专利技术提供的巨大芽孢杆菌BM22对厚朴根腐病和立枯病有特效，且具有抗逆性，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产，不仅能避免化学药物所造成的污染环境的严重后果，而且具有可持续、成本低的特点。

Preparation and application of Bacillus metilis BM22 and its liquid preparations

The invention discloses the preparation and application of a Bacillus megalobacter BM22 and its liquid preparation. The strain has been preserved in the China General Microbial Species Preservation and Management Center on December 15, 2017, and the preservation number is CGMCC No. 15070. Bacillus subtilis BM22 was used as a strain to prepare liquid preparations by seed culture and fermentation. The Bacillus Mega BM22 provided by the invention has special effect on root rot and wilt of Magnolia officinalis, and has the characteristics of stress resistance, good storage, high temperature resistance, low temperature resistance and dry resistance. It is suitable for commercial production. It can not only avoid serious environmental pollution caused by chemical drugs, but also has the characteristics of sustainable development and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种巨大芽孢杆菌BM22及其液体制剂的制备和应用
本专利技术属于微生物
，涉及一种巨大芽孢杆菌，具体涉及一种巨大芽孢杆菌BM22菌株及其液体制剂和在厚朴根腐病和立枯病防治上的应用。
技术介绍
厚朴为木兰科木兰属植物，主产湖北和四川，又称为紫油厚朴、川朴，在浙江、安徽、福建、甘肃、贵州、云南等省也有分布，多栽种于海拔800-1700m左右的山区。厚朴是我国特有的传统中药，常以树皮、根皮、枝皮入药，4～6月剥取根皮及枝皮直接阴干，干皮置沸水中微煮后堆置阴湿处，“发汗”至内表面皮紫褐色或棕褐色时，蒸软取出，卷成筒状，干燥。切丝，姜制用。对食积气滞、腹胀便秘、湿阻中焦等疾病有治疗作用。还能加入癌症药物中。厚朴是国家Ⅱ级重点保护野生植物，属于渐危种。厚朴苗期易发生根腐病和立枯病，根腐病危害树根及茎干和树枝，发病初期由树根、支根变褐、腐烂逐渐向主根蔓延，最后导致全根腐烂，根茎生暗黑斑纹，地上茎叶自下向上枯萎，最终全株死亡。拔出病株可见主根上部和根茎地下部呈黑色，病部凹陷，维管束呈褐色。立枯病多发生在育苗的中后期，主要危害幼苗茎基部或地下根部，初为椭圆形或不规则暗褐色病斑，病苗萎蔫，病部凹陷溢缩，有的渐变为黑褐色，当病斑扩大绕茎一周时即干枯死亡，但不倒伏。目前生产中主要通过营林措施清除病源来进行防治，一般以化学农药、化学肥料为主，但由于长时期施用化学农药(肥料)易污染环境，破坏生态，病害综合防治措施的探讨还有待开展。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术在防治厚朴根腐病和立枯病中的缺陷，提供了巨大芽孢杆菌BM22及其液体制剂在防治厚朴根腐病和立枯病中的应用。本专利技术具体通过以下技术方案实现：本专利技术的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)BM22菌株于2017年6月15日采用平板稀释涂布法分离于四川大邑仰天窝药场健康杜仲叶片，已经于2017年12月15日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.15070。本专利技术巨大芽孢杆菌BM22在NA平板培养基上培养了2d的单菌落呈乳白色，圆形，表面粗糙，边缘波纹状，不透明，无粘性。本专利技术巨大芽孢杆菌BM22的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术以巨大芽孢杆菌BM22为活性成分的液体制剂，由巨大芽孢杆菌BM22为菌种，经种子培养、发酵培养得到液体制剂。本专利技术所述的以巨大芽孢杆菌BM22为菌种的液体制剂中含活芽孢数不低于1×109cfu/g。本专利技术所述的以巨大芽孢杆菌BM22为菌种的液体制剂通过以下方法制备：1)一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种巨大芽孢杆菌BM22后，培养制成一级种子；2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌BM22斜面种子，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌BM22液体种子；3)液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌液体种子，接种量为液体总体积的15％，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌BM22液体制剂，然后保存。所述的牛肉膏蛋白胨斜面培养基的成分为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl3.5g，琼脂18g，水1000mL。所述的营养肉质培养液的成分为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl5g，厚朴根皮浸渍液1000mL。上述制备方法得到的以巨大芽孢杆菌BM22活性成分的液体制剂也在本专利技术保护的范围之内。专利技术所述的巨大芽孢杆菌BM22在防治厚朴根腐病和立枯病中的应用。本专利技术所述的巨大芽孢杆菌BM22液体制剂在防治厚朴根腐病和立枯病中的应用，在苗期或植物生长过程中进行喷雾或灌根施用。所述的液体制剂在治疗厚朴根腐病和立枯病中的应用，其液体制剂稀释液为将液体制剂制成浓度为1×109cfu/mL，然后再稀释施用。当然，本专利技术所述的巨大芽孢杆菌BM22的菌悬液或次级代谢产物在作为制备防治厚朴根腐病和立枯病药物中的应用也在本专利技术的保护范围内。本专利技术巨大芽孢杆菌BM22防治厚朴根腐病和立枯病的方法也属于本专利技术的保护范围，该方法是在厚朴苗期或生长过程中进行喷雾或灌根施用；所述制剂为该巨大芽孢杆菌BM22的菌悬液或发酵液或代谢产物或制剂。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的巨大芽孢杆菌BM22对厚朴根腐病和立枯病有特效，经试验显示对厚朴根腐菌和立枯菌的抑制率达到98.17％和96.63％，将该巨大芽孢杆菌BM22制成液体制剂，同样表现有良好的防治效果，适宜于商品化生产，不仅能避免化学药物所造成的污染环境的严重后果，且具有抗逆性，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥的特点，同时符合国家可持续发展的战略，相比化学药物还具有成本低的特点，具有广泛的应用前景。附图说明图1是本专利技术巨大芽孢杆菌BM22rDNA-ITS序列PCR扩增产物电泳图；图2是基于16SrDNA序列构建的菌株BM22的系统发育树。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本专利技术的保护范围内。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1巨大芽孢杆菌BM22的分离与鉴定1.1内生细菌的分离、纯化与保存在四川大邑仰天窝药场杜仲黑斑病发生区取健康杜仲叶片。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g组织，在70％的酒精中浸泡1-2min，再用1-3％次氯酸钠溶液消毒3-5min，无菌水洗涤若干遍后，吸取最后一次洗涤液100μL涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，27℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。将已表面消毒的树皮组织剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10mL无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5共5个梯度，分别吸取100μL10-3，10-4，10-5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，每个处理3次重复，27℃培养48h，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4℃保藏备用。共获36个内生细菌。1.2内生细菌对厚朴根腐病菌和立枯病菌的平板拮抗作用平板对峙法：在培养皿中央接种7d的厚朴根腐菌(Fusariumoxysporum)和厚朴立枯病菌(Rhizoctoniasolani)菌饼(直径6mm)，离该病菌饼约3cm处，分别用接种环沾取培养2d的内生菌，在病菌对称两侧各划一条细线，28℃培养，以只接种病菌的平板为对照，待对照长满皿时测量病菌的菌落生长本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种巨大芽孢杆菌BM22，其特征在于，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15070。

【技术特征摘要】
1.一种巨大芽孢杆菌BM22，其特征在于，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.15070。2.根据权利要求1所述的一种巨大芽孢杆菌BM22，其特征在于，所述的巨大芽孢杆菌BM22的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。3.一种以巨大芽孢杆菌BM22为活性成分的液体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种巨大芽孢杆菌后，培养制成一级种子；2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌斜面种子，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌液体种子；3)液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌液体种子，接种量为液体总体积的15％，振荡...

【专利技术属性】
技术研发人员：李姝江，曾艳玲，李书颖，朱天辉，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51