霉菌的培养方法、破壁方法及DNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种霉菌的培养方法、破壁方法，包括①在研磨容器中加入第一CTAB抽提液，将研磨容器进行冷冻，并使第一CTAB抽提液变为冰冻态；②在冷冻之后的研磨容器中加入霉菌及第二CTAB抽提液；以及③对霉菌进行研磨以破坏霉菌的细胞壁，并与第一CTAB抽提液及第二CTAB抽提液形成第一混合溶液等步骤；本发明专利技术还公开了一种相应的霉菌DNA的提取方法，包括在第一混合溶液中加入质量体积浓度为10%的SDS溶液，进行温浴，形成第二混合溶液；将第二混合溶液离心，得到第一上清液，第一上清液中含有霉菌的DNA；以及在第一上清液中加入苯酚‑氯仿‑异戊醇抽提液，混匀后离心，得到第二上清液，第二上清液中含有霉菌的DNA。本发明专利技术适用于对霉菌进行培养、破壁和DNA提取。

Mold culture, wall breaking method and DNA extraction method

The invention discloses a mold culture method and a wall breaking method, which comprises: (1) adding the first CTAB extract to the grinding container to refrigerate the grinding container and turning the first CTAB extract into a frozen state; (2) adding mold and the second CTAB extract to the grinding container after refrigeration; (3) grinding the mold to make the first CTAB extract frozen. The invention also discloses a corresponding method for extracting mold DNA, which includes adding SDS solution with a mass volume concentration of 10% in the first mixed solution to conduct a warm bath to form a second mixed solution. The mixed solution was centrifuged to obtain the first supernatant, the first supernatant containing mold DNA, and the first supernatant containing phenol chloroform isoamyl alcohol extract, mixed and centrifuged to obtain the second supernatant, the second supernatant containing mold DNA. The invention is suitable for cultivating moulds, breaking walls and extracting DNA.

【技术实现步骤摘要】
霉菌的培养方法、破壁方法及DNA提取方法
本专利技术属于微生物
，涉及微生物的处理技术，具体地说是一种霉菌的培养方法、破壁方法及DNA提取方法。
技术介绍
20世纪50年代后，随着人们对微生物基因的深刻认识，已广泛应用于各方面，同时对于微生物的研究也已经深入到核酸的水平。DNA是遗传信息的载体，是重要的遗传物质。其中基因组DNA提取作为分子实验中基础而重要的技术手段已经应用在了各个研究领域。而DNA样品的质量以及数量的高低对进行各种分子生物学研究有着重要的影响。霉菌俗称丝状真菌，由于霉菌的种类繁多，仅依靠形态鉴定并不能准确地鉴定其种类，所以对霉菌进行分子水平的鉴定至关重要，而提取高质量的DNA是霉菌进行分子水平鉴定的基础。且因为霉菌的细胞壁包括β-葡聚糖、糖蛋白、几丁质微纤维三层结构，因此使得霉菌的细胞壁不易破碎。传统的霉菌DNA提取方法，往往存在对霉菌DNA的提取量少，且提取的DNA不完整的问题。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的以上不足，本专利技术旨在提供一种霉菌的培养方法、破壁方法及DNA提取方法，以实现对霉菌DNA的提取量大且提取的DNA完整的目的。本专利技术为实现上述目的，所采用的技术方案如下：一种霉菌的培养方法，按照如下的步骤顺序进行：（1）霉菌菌丝的收集将马铃薯洗净、去皮，称取200ɡ切成小块，添加500mL去离子水煮烂之后用八层纱布过滤，于过滤汁中添加16～20ɡ琼脂和20g葡萄糖，冷却后定容至1000mL，加盖密封，115℃灭菌20min后，冷却至50℃后倾倒平板，得马铃薯琼脂培养基；将冷藏于4℃冰箱中的霉菌接种于马铃薯琼脂培养基的平板上，28～30℃恒温培养48h；之后，再转接于新鲜马铃薯琼脂培养基，如此重复2～3次，得活化后的霉菌；（2）活化好的霉菌再次转接于新鲜的马铃薯琼脂培养基上，28～30℃恒温培养48h后，利用锋利的灭菌刀片刮取平板上的菌丝，得到霉菌菌丝体。本专利技术还提供了一种霉菌的破壁方法，它包括顺序进行的以下步骤：①在研磨容器中加入第一CTAB抽提液a1，将所述研磨容器进行冷冻，使所述a1变为冰冻态；然后，②在研磨容器中加入霉菌菌丝体及第二CTAB抽提液a2；③对所述霉菌进行研磨，研磨至看不到菌丝体，达到均匀混合液状，以破坏所述霉菌菌丝体的细胞壁，并与第一CTAB抽提液a1、第二CTAB抽提液a2共同形成第一混合溶液b1。作为限定，所述步骤①中，冷冻的温度为-30～-15℃，时间为1～1.5h。作为另一种限定，第一CTAB抽提液a1、霉菌菌丝体与第二CTAB抽提液a2的用量比为1mL：0.5～2g：0.5～2mL。作为第三种限定，第一CTAB抽提液a1与第二CTAB抽提液a2均为CTAB抽提液，即液体a，第一CTAB抽提液a1与第二CTAB抽提液a2的体积相同。本专利技术所提供的霉菌的破壁方法还有一种限定，所述液体a由CTAB、氯化钠、EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液及β-巯基乙醇以1ɡ：4.09ɡ：2mL：5mL：0.25ɡ的比例制得，先由CTAB、氯化钠、EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液混合后由蒸馏水定容，121℃灭菌15min，冷却后加入β-巯基乙醇，即成；其中：EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液的浓度分别为0.5M、1M；蒸馏水定容后的体积与CTAB的用量比为50mL：1ɡ。本专利技术的第三个目的，是提供了一种霉菌DNA的提取方法，本专利技术实现该目的所采用的技术方案如下：一种霉菌DNA的提取方法，它包括顺序进行的如下步骤：ⅰ.通过前述的霉菌的破壁方法得到第一混合溶液b1；ⅱ.在第一混合溶液b1中加入质量体积浓度为10%的SDS溶液d，进行温浴后，形成第二混合溶液b2；第二混合溶液b2进行离心，得到第一上清液c1，所述第一上清液c1中含有所述霉菌的DNA；ⅲ.第一上清液中c1中加入苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e1，混匀后离心，得到含有所述霉菌的DNA的第二上清液c2。作为一种限定，所述SDS溶液d与所述第一混合溶液b1的体积比为1：8～12。作为另一种限定，所述温浴的温度为50-80℃，时间为20～30min。作为第三种限定，所述苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e1与所述第一上清液c1的体积比为1：0.8～1.2。作为第四种限定，离心的转速为5000～8000r/min，离心时间为5～6min。作为优化，本专利技术所提供的霉菌DNA的提取方法，在步骤ⅲ后还设有步骤ⅳ，即：ⅳ.在第二上清液c2中加入苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e2，混匀后离心，得到含有所述霉菌的DNA的第三上清液c3。作为进一步优化，第二上清液c2与苯酚-氯仿-异戊醇抽提液e2的体积比为：1：0.8～1。作为进一步的优化，最终的上清液，即第二上清液c2或第三上清液c3，加入预冷的2～2.2倍体积的无水乙醇中，缓慢抽吸混匀；静置1～2min，使霉菌DNA沉淀；在12000r/min转速下离心8～12min，去掉第二上清液c2或第三上清液c3，得到需要提取的霉菌DNA；霉菌DNA溶解于TE缓冲液中，于-20℃条件下保存。可以使用琼脂糖凝胶电泳和全波长酶标仪对提取的DNA进行测定。本专利技术由于采用了上述的技术方案，其与现有技术相比，所取得的技术进步在于：本专利技术所提供的霉菌的培养方法通过PDA培养基对霉菌活化2~3次。在适宜的温度和培养基中培养得到的霉菌生长旺盛，菌丝体活性高，为下一步菌丝体的收集做好充分准备。所采用的PDA培养基具有营养成分均衡、配制简单的优点；本专利技术所提供的霉菌的破壁方法，通过冷冻对研磨容器进行降温处理，并使第一CTAB抽提液变为冰冻态。在对霉菌进行研磨的过程中，经过降温的研磨容器以及冰冻态的第一CTAB抽提液的双重保障可以提供低温的研磨环境，使对霉菌的研磨处理在温度较低的环境下进行，从而能够最大程度的保证研磨之后的DNA的完整性；本专利技术所提供的霉菌DNA的提取方法具备前面所述的霉菌的破壁方法的优点，在此不再赘述，该霉菌DNA的提取方法同时还具有省时、经济等优点。本专利技术适用于对霉菌进行培养、破壁和DNA提取。附图说明下面结合附图及具体实施例对本专利技术作更进一步的详细说明。图1为本专利技术实施例21提取的霉菌DNA电泳图；图2为本专利技术实施例22提取的霉菌DNA电泳图；图3为本专利技术对比例实施例23提取的霉菌DNA电泳图；图4为本专利技术实施例24提取的霉菌DNA电泳图；图5为本专利技术实施例25提取的霉菌DNA电泳图。具体实施方式实施例1-5霉菌的培养方法实施例1-5分别为一种霉菌的培养方法，按照如下的步骤顺序进行：（1）霉菌菌丝的收集将马铃薯洗净、去皮，称取200ɡ切成小块，添加500mL去离子水煮烂之后用八层纱布过滤，于过滤汁中添加16～20ɡ琼脂和20g葡萄糖，冷却后定容至1000mL，加盖密封，115℃灭菌20min后，冷却50℃后倾倒平板，得马铃薯琼脂培养基；将冷藏于4℃冰箱中的霉菌接种于马铃薯琼脂培养基的平板上，28～30℃恒温培养48h；之后，再转接于新鲜马铃薯琼脂培养基，如此重复r=2～3次，得活化后的霉菌；（2）活化好的霉菌再次转接于新鲜的马铃薯琼脂培养基上，28～30℃恒温培养48h后，利用锋利的灭菌刀片刮取平板上的菌丝，即霉菌菌丝体。实施例1－5的相关控制参数见下表：实施例6－14霉菌的破壁方法实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种霉菌的培养方法，其特征在于它按照如下的步骤顺序进行：（1）霉菌菌丝的收集将马铃薯洗净、去皮，称取200ɡ切成小块，添加500mL去离子水煮烂之后用八层纱布过滤，于过滤汁中添加16～20ɡ琼脂和20g葡萄糖，冷却后定容至1000mL，加盖密封，115℃灭菌20min后，冷却至50℃后倾倒平板，得马铃薯琼脂培养基；将冷藏于4℃冰箱中的霉菌接种于马铃薯琼脂培养基的平板上，28～30℃恒温培养48h；之后，再转接于新鲜马铃薯琼脂培养基，如此重复2～3次，得活化后的霉菌；（2）活化好的霉菌再次转接于新鲜的马铃薯琼脂培养基上，28～30℃恒温培养48 h后，利用锋利的灭菌刀片刮取平板上的菌丝，得到霉菌菌丝体。

【技术特征摘要】
1.一种霉菌的培养方法，其特征在于它按照如下的步骤顺序进行：（1）霉菌菌丝的收集将马铃薯洗净、去皮，称取200ɡ切成小块，添加500mL去离子水煮烂之后用八层纱布过滤，于过滤汁中添加16～20ɡ琼脂和20g葡萄糖，冷却后定容至1000mL，加盖密封，115℃灭菌20min后，冷却至50℃后倾倒平板，得马铃薯琼脂培养基；将冷藏于4℃冰箱中的霉菌接种于马铃薯琼脂培养基的平板上，28～30℃恒温培养48h；之后，再转接于新鲜马铃薯琼脂培养基，如此重复2～3次，得活化后的霉菌；（2）活化好的霉菌再次转接于新鲜的马铃薯琼脂培养基上，28～30℃恒温培养48h后，利用锋利的灭菌刀片刮取平板上的菌丝，得到霉菌菌丝体。2.一种霉菌的破壁方法，其特征在于它包括顺序进行的以下步骤：①在研磨容器中加入第一CTAB抽提液a1，将所述研磨容器进行冷冻，使所述a1变为冰冻态；然后，②在研磨容器中加入霉菌菌丝体及第二CTAB抽提液a2；以及③对所述霉菌菌丝体进行研磨后，并与第一CTAB抽提液a1、第二CTAB抽提液a2共同形成第一混合溶液b1。3.根据权利要求2所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：所述步骤①中，冷冻的温度为-30～-15℃，时间为1～1.5h。4.根据权利要求2所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：第一CTAB抽提液a1、霉菌菌丝体与第二CTAB抽提液a2的用量比为1mL：0.5～2g：0.5～2mL。5.根据权利要求2所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：第一CTAB抽提液a1与第二CTAB抽提液a2均为CTAB抽提液，即液体a，第一CTAB抽提液a1与第二CTAB抽提液a2的体积相同。6.根据权利要求5所述的霉菌的破壁方法，其特征在于：所述液体a由CTAB、氯化钠、EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液及β-巯基乙醇以1ɡ：4.09ɡ：2mL：5mL：0.25ɡ的比例制得，先由CTAB、氯化钠、EDTA溶液、Tris-HCL缓冲液混合后由蒸馏水定容，121℃灭菌15min，冷却后加入β-巯基乙醇，即成；其中：EDTA溶液、Tris-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，牟德华，文淑婷，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：河北,13