一种高活性卵类粘蛋白的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种高活性卵类粘蛋白的分离方法，属于蛋白分离技术领域，其步骤为：1)、鸡蛋清处理液的制备，2)、层析分离，3)、蛋白纯度检测，4)、蛋白质的浓缩。本发明专利技术采用CM‑Sepharose FF高效分离卵类粘蛋白，样品处理不使用有机溶剂，分离过程简单，分离耗时短，以期获得高免疫活性的卵类粘蛋白纯品。经过蛋白纯度检测验证和免疫活性评估，与sigma公司卵类粘蛋白纯品相似度高，表明其具备较高的免疫活性。

A method for separating highly active egg mucin

The invention discloses a method for separating highly active oomyxoid protein, belonging to the technical field of protein separation. The steps are: 1), preparation of egg white treatment solution, 2), chromatography separation, 3), protein purity detection, 4), protein concentration. The invention adopts CM_Sepharose FF to efficiently separate oomyxoid protein. Sample processing does not use organic solvents, the separation process is simple and the separation time is short, so as to obtain pure oomyxoid protein with high immunological activity. After protein purity testing and evaluation of immune activity, it has a high similarity with sigma oomyxoid protein purity, indicating that it has a high immune activity.

【技术实现步骤摘要】
一种高活性卵类粘蛋白的分离方法
本专利技术涉及蛋白质分离
，具体为一种高活性卵类粘蛋白的分离方法。
技术介绍
鸡蛋中的过敏原主要存在于蛋清中，目前公认卵类粘蛋白是蛋清中致敏性最强的过敏原。因此，卵类黏蛋白致敏性的控制是低致敏或者无致敏鸡蛋产品研发的关键点。然而，已报道的卵类粘蛋白分离方法仅有以下几种：有机溶剂沉淀法[1,2]，离子交换层析法[3,4]，以及双水相萃取法[5]。[1]AbeyrathneED,LeeHY,AhnDU.Separationofovotransferrinandovomucoidfromchickeneggwhite.PoultSci,2014,93(4):1010-7.[2]王帅,吴子健,王素英,刘建福,张伟帖,航荣强.三步沉淀法纯化鸡卵类黏蛋白.食品科学,2014,35(24):74-80.[3]TankrathokA,DaduangS,PatramanonR,ArakaiT,ThammasirirakS.Purificationprocessforthepreparationandcharacterizationofheneggwhiteovalbumin,lysozyme,ovo-transferrinandovomucoid.PrepBiochemBiotechnol,2009,39(4):380–99[4]麻小娟,陈红兵,高金燕.鸡蛋清中卵白蛋白和卵类粘蛋白的高效分离.中国食品科学技术学会第六届年会暨第五届东西方食品业高层论坛论文摘要集,2009:111.[5]OliveiraFCD,CoimbraJSDR,SilvaLHMD,RojasEEG,SilvaMDCHD.Ovomucoidpartitioninginaqueoustwo-phasesystems.BiochemEngJ,2009,47(1):55-60.其中双水相萃取法处理样品量少，不具实际应用价值；有机溶剂沉淀法需要有机溶剂的辅助，容易引起蛋白质变性；而已报道的离子交换层析均是经过一种层析柱粗分离，得到的粗蛋白处理后再次上样另一种层析柱，操作较为繁琐，也易引起蛋白质变性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述
技术介绍
困难，提供一种高活性卵类粘蛋白的分离方法。为达到上述目的，采用的技术方案为：一种高活性卵类粘蛋白的分离方法，其步骤为：1)、鸡蛋清处理液的制备：新鲜鸡蛋去壳并分离出蛋清，加入等体积蒸馏水后置于冰浴中，用玻璃棒缓慢搅拌直到胶状部分消失；用2MHCl调pH到6.0，冰浴中搅拌3h后,离心除去球蛋白等干扰蛋白；上清液继续滴加2MHCl调至pH3.8，冰浴中搅拌3h，再次离心，将上清液分装成5ml每管冻存备用；2)、层析分离：用醋酸-醋酸钠pH4.7平衡CM-sepharoseFF层析柱1.5×20cm，至紫外监测仪读数稳定；上样5ml鸡蛋清处理液，控制流速在1.5ml/min，继续用pH4.7的醋酸盐缓冲液进行洗脱，同时连通记录仪，洗脱结束后收集蛋白样品；3)、蛋白纯度检测：将分离所得蛋白收集，取样10μl与10μl上样缓冲液混合后，取15μl加入聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE胶孔内，电泳后，凝胶经考马斯亮蓝显色；4)、蛋白质的浓缩：将收集到的卵类粘蛋白纯品用PEG浓缩，透析后冻干，于-20℃冻存。所述步骤3)中，聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE为12％分离胶，5％浓缩胶。分离的高活性卵类粘蛋白免疫活性评估方法，其步骤为：首先用待评估的卵类粘蛋白免疫日本大白兔获得兔抗卵类粘蛋白多克隆抗体：初次免疫采用弗氏完全佐剂与蛋白质1:1混匀，加强免疫采用弗氏不完全佐剂与蛋白质1:1混匀；每次免疫剂量为1mg卵类粘蛋白纯品，免疫间隔14天；待效价进入平稳期采集兔血清，按照常规竞争抑制ELISA步骤，比较待评估的卵类粘蛋白和标准卵类粘蛋白纯品的IgG结合能力；将样品的吸光值按照下式转换成抑制百分比：其中A2指竞争抗原某一特定稀释度下的吸光值，A1是阳性对照最大蛋白浓度的吸光值，A0是阴性对照吸光值。采用上述方案的有益效果为：本专利技术采用CM-SepharoseFF高效分离卵类粘蛋白，样品处理不使用有机溶剂，分离过程简单，分离耗时短，以期获得高免疫活性的卵类粘蛋白纯品。经过蛋白纯度检测验证和免疫活性评估，与sigma公司卵类粘蛋白纯品相似度高，表明其具备较高的免疫活性。附图说明图1为本专利技术实施例中鸡蛋卵类黏蛋白的洗脱曲线示意图。图2为本专利技术实施例中过敏原蛋白SDS-PAGE的分离图。图3为本专利技术实施例中BCA蛋白试剂盒标准曲线。图4为专利技术实施例中卵类粘蛋白分离纯化品和标准品的IgG结合能力对比图。具体实施方式下面结合实施例进一步介绍本专利技术，但本专利技术不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。一种高活性卵类粘蛋白的分离方法，其步骤为：1.鸡蛋清处理液的制备：新鲜鸡蛋去壳并分离出蛋清，加入等体积蒸馏水后置于冰浴中，用玻璃棒缓慢搅拌直到胶状部分消失。用2MHCl调pH到6.0。冰浴中搅拌3h后,离心除去球蛋白等干扰蛋白。上清液继续滴加2MHCl调至pH3.8,冰浴中搅拌3h，再次离心，保留上清。将上清分装成5ml/管冻存备用。2.层析分离：用醋酸-醋酸钠(pH4.7)平衡CM-sepharoseFF层析柱(1.5×20cm)，至紫外监测仪读数稳定。上样5ml鸡蛋清处理液。控制流速在1.5ml/min。继续用pH4.7的醋酸盐缓冲液进行洗脱，同时连通记录仪。洗脱结束后收集蛋白样品。3.蛋白纯度检测：将分离所得蛋白收集，取样10μl与10μl上样缓冲液混合后，取15μl加入聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)胶孔内(12％分离胶，5％浓缩胶)，电泳后，凝胶经考马斯亮蓝显色。4.蛋白质的浓缩：将收集到的卵类粘蛋白纯品用PEG浓缩，透析后冻干。于-20℃冻存。5.提取率计算：用BCA法测定蛋清处理液中以及分离纯化卵类粘蛋白的量，查阅文献，卵类粘蛋白的质量分数为11％，计算出卵类粘蛋白的提取率。6.分离卵类粘蛋白免疫活性评估：首先用分离纯化的卵类粘蛋白免疫日本大白兔获得兔抗卵类粘蛋白多克隆抗体。免疫过程如下：初次免疫采用弗氏完全佐剂与蛋白质1:1(v/v)混匀，加强免疫采用弗氏不完全佐剂与蛋白质1:1(v/v)混匀。每次免疫剂量为1mg卵类粘蛋白纯品，免疫间隔14天。待效价进入平稳期采集兔血清用于以下检测：利用以上兔血清，按照常规竞争抑制ELISA步骤，比较分离纯化的卵类粘蛋白和sigma公司卵类粘蛋白纯品的IgG结合能力。酶标板用卵类粘蛋白纯化品包被，采用板外竞争，竞争抗原分别为分离纯化的卵类粘蛋白和sigma公司卵类粘蛋白纯品。IgG结合能力的计算如下：样品的吸光值按照下式转换成抑制百分比(％inhibition)其中A2指竞争抗原某一特定稀释度下的吸光值，A1是阳性对照最大蛋白浓度的吸光值(最小吸光值)，A0是阴性对照吸光值(最大吸光值)。如图1为本专利技术实施例中鸡蛋卵类黏蛋白的洗脱曲线。如图2为专利技术实施例中过敏原蛋白SDS-PAGE的分离图，右图为浓缩后的卵类粘蛋白(注：由于卵类黏蛋白含20％-25％的糖基成分，电泳时分子量显示偏大，条带弥散属正常现象)。可见分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高活性卵类粘蛋白的分离方法，其特征步骤为：1)、鸡蛋清处理液的制备：新鲜鸡蛋去壳并分离出蛋清，加入等体积蒸馏水后置于冰浴中，用玻璃棒缓慢搅拌直到胶状部分消失；用2M HCl调pH到6.0，冰浴中搅拌3h后,离心除去球蛋白等干扰蛋白；上清液继续滴加2M HCl调至pH3.8,冰浴中搅拌3h，再次离心，将上清液分装成5ml每管冻存备用；2)、层析分离：用醋酸‑醋酸钠pH4.7平衡CM‑sepharose FF层析柱1.5×20cm，至紫外监测仪读数稳定；上样5ml鸡蛋清处理液，控制流速在1.5ml/min，继续用pH4.7的醋酸盐缓冲液进行洗脱，同时连通记录仪，洗脱结束后收集蛋白样品；3)、蛋白纯度检测：将分离所得蛋白收集，取样10μl与10μl上样缓冲液混合后，取15μl加入聚丙烯酰胺凝胶SDS‑PAGE胶孔内，电泳后，凝胶经考马斯亮蓝显色；4)、蛋白质的浓缩：将收集到的卵类粘蛋白纯品用PEG浓缩，透析后冻干，于‑20℃冻存。

【技术特征摘要】
1.一种高活性卵类粘蛋白的分离方法，其特征步骤为：1)、鸡蛋清处理液的制备：新鲜鸡蛋去壳并分离出蛋清，加入等体积蒸馏水后置于冰浴中，用玻璃棒缓慢搅拌直到胶状部分消失；用2MHCl调pH到6.0，冰浴中搅拌3h后,离心除去球蛋白等干扰蛋白；上清液继续滴加2MHCl调至pH3.8,冰浴中搅拌3h，再次离心，将上清液分装成5ml每管冻存备用；2)、层析分离：用醋酸-醋酸钠pH4.7平衡CM-sepharoseFF层析柱1.5×20cm，至紫外监测仪读数稳定；上样5ml鸡蛋清处理液，控制流速在1.5ml/min，继续用pH4.7的醋酸盐缓冲液进行洗脱，同时连通记录仪，洗脱结束后收集蛋白样品；3)、蛋白纯度检测：将分离所得蛋白收集，取样10μl与10μl上样缓冲液混合后，取15μl加入聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE胶孔内，电泳后，凝胶经考马斯亮蓝显色...

【专利技术属性】
技术研发人员：麻小娟，梁汭，黄厚今，胡斌丽，李岩，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52