用于检测福氏志贺氏菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术提供用于检测福氏志贺氏菌的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’‑AGACGCCATCTCTTCTCG‑3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’‑TATAGTTTAGCTTGCCTTT‑3’；下游引物序列为5’‑CTATTTCTGATAAATTCAAGTTAT‑3’。本发明专利技术提供用于福氏志贺氏菌进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取福氏志贺氏菌的基因组DNA，结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中福氏志贺氏菌含量的目的，具有高灵敏度和高特异性。本发明专利技术所提供的引物和探针对判断福氏志贺氏菌活性菌的含量以至于后续研究泌尿道感染具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
用于检测福氏志贺氏菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR试剂盒
本专利技术属于分子生物学和体外诊断试剂
，具体涉及用于检测福氏志贺氏菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR试剂盒。
技术介绍
福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)是一类革兰阴性短小杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，主要流行于发展中国家，通称痢疾杆菌，福氏志贺氏菌能够引起细菌性痢疾。细菌性痢疾是最常见的肠道传染病，夏秋两季患者最多。传染源主要为病人和带菌者，通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等经口感染。人类对志贺氏菌易感，10～200个细菌可使10～50％志愿者致病。一般说来，福氏志贺氏菌所致菌痢的病情较重。传统的诊断福氏志贺氏菌的方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判定，不利于及时找到病原，诊断病因。PCR技术作为一种分子生物学工具，可以选择性体外扩增DNA或RNA片段，操作简单、特异性强、快速、敏感性高等特点。TaqMan探针法检测特异性强，灵敏度高，方便优化反应条件，能够用于福氏志贺氏菌的快速检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于设计一组福氏志贺氏菌特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于福氏志贺氏菌检测的快速、灵敏、特异性好的用荧光定量PCR检测的方法。本专利技术采用基因克隆技术，将福氏志贺氏菌16s基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有16s基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据福氏志贺氏菌16s基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。本专利技术的第一个目的是提供用于检测福氏志贺氏菌的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’-AGACGCCATCTCTTCTCG-3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’-TATAGTTTAGCTTGCCTTT-3’；下游引物序列为5’-CTATTTCTGATAAATTCAAGTTAT-3’。作为优选，探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。作为优选，所述上游引物和所述下游引物为向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测福氏志贺氏菌的实时荧光定量PCR试剂盒，所述实时荧光定量PCR试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的特异性引物和探针。作为优选，在20μlPCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.2μl，所述下游引物的用量为0.2μl，所述探针的用量为0.2μl。作为优选，所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括系列浓度标准品和阳性对照；所述系列浓度标准品是将福氏志贺氏菌16S基因与载体连接，转化至感受态细胞中诱导表达，提取重组质粒，将重组质粒定量后稀释，得到系列浓度标准品。作为优选，所述标准品的核苷酸序列为序列表中序列2。本专利技术的第三个目的是提供上述特异性引物和探针、实时荧光定量PCR试剂盒在如下任一中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的：(1)定性或定量检测或辅助检测福氏志贺氏菌；(2)制备定性或定量检测或辅助检测福氏志贺氏菌的产品。本专利技术的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待检样品中是否含有福氏志贺氏菌的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，分别以系列浓度标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。本专利技术提供用于福氏志贺氏菌进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取福氏志贺氏菌的基因组DNA，结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中福氏志贺氏菌含量的目的，具有高灵敏度(灵敏度为1.00×102copies/ml)和高特异性(能够特异性的从鼠李糖乳杆菌、肺炎克伯菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、阪崎肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、乙型溶血性链球菌、破伤风梭菌、铜绿假单胞菌、干酪乳杆菌、副溶血弧菌、嗜热链球菌、奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、淋病奈瑟菌、肺炎链球菌、福氏志贺氏菌、沙门氏菌、化脓链球菌、幽门螺旋杆菌中特异性的检测到福氏志贺氏菌)。本专利技术所提供的引物和探针可对福氏志贺氏菌含量进行定性、定量分析，对判断福氏志贺氏菌活性菌的含量以至于后续研究泌尿道感染具有重要意义，本专利技术将在微生物临床检测领域发挥重要作用。下面结合附图以及具体实施方案对本专利技术做更详细阐述。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为NCBI数据库blast比对结果。图2为上下游引物序列经NCBI中Primer-Blast比对结果。图3为本专利技术标准品的标准曲线。图4为本专利技术灵敏度实验结果。图5为本专利技术特异性实验结果。图6为本专利技术特异性实验凝胶成像验证图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和完成。实施例116s基因标准品的制备要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。16S基因广泛存在于福氏志贺氏菌中，具有很高的保守性。本专利技术采用福氏志贺氏菌16s基因作为靶序列。本实施例主要采用PCR技术扩增福氏志贺氏菌16s基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-16s，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。一、模板DNA的制备提取福氏志贺氏菌(标准菌株)基因组DNA，用作16s基因PCR扩增的模板。采用北京百泰克公司生产的细菌基因组提取试剂盒来提取，具体提取方法如下：①取1ml菌悬液，加入1.5ml离心管，8000r/min离心2分钟，弃上清液；②加入400μlBufferDigestion悬浮菌液沉淀，混匀后放入65℃水浴1h至细胞完全裂解；③加入200μlBufferPB混匀-20℃静置5min，离心取上清；④加入600μl异丙醇混匀-20℃静置5min，离心弃上清；⑤加入1ml75％乙醇-20℃静置5min，离心弃上清；⑥沉淀用75％的乙醇洗涤，干燥；⑦溶于50μlTEBuffer中，-20℃保存。二、16s基因片段的PCR扩增1、引物的设计与合成16SrDNA鉴定是利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。是一种快速获得细菌种属信息的方法。本专利技术利用实时荧光定量PCR检测福氏志贺氏菌16SrDNA基因表达水平，明确16SrDNA在福氏志贺氏菌检测中的意义及特异性。本专利技术通过对NCBI数据库中福氏志贺氏菌16s基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，应用Primerexpress3软件、PrimerPremier5软本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测福氏志贺氏菌的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针序列为：5’‑AGACGCCATCTCTTCTCG‑3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’‑TATAGTTTAGCTTGCCTTT‑3’；下游引物序列为5’‑CTATTTCTGATAAATTCAAGTTAT‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于检测福氏志贺氏菌的特异性引物和探针，其特征在于：所述探针序列为：5’-AGACGCCATCTCTTCTCG-3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’-TATAGTTTAGCTTGCCTTT-3’；下游引物序列为5’-CTATTTCTGATAAATTCAAGTTAT-3’。2.根据权利要求1所述的特异性引物和探针，其特征在于：探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。3.根据权利要求1所述的特异性引物和探针，其特征在于：所述上游引物和所述下游引物为向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。4.一种用于检测福氏志贺氏菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的特异性引物和探针。5.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：在20μlPCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.2μl，所述下游引物的用量为0.2μl，所述探针的用量为0.2μl。6.根据权利要求4或5所述的实时荧光定量PCR试...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴玲，徐红，车团结，陈游，高恺，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32