一种检测嗜肺军团菌毒力的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测嗜肺军团菌毒力的方法，包括(1)将NF‑κB报告质粒(pNFκB‑luc)和海参荧光素酶报告质粒(pRL‑CMV)转入HEK 293T细胞中。(2)测定军团菌：将嗜肺军团菌浓度调至相同，使用200ul感染转染24小时后的HEK 293T细胞或稳定表达细胞系。(3)肺军团菌感染HEK 293T细胞24h后，用Dual‑Luciferase Reporter Assay System试剂盒及GloMax Multi多功能检测仪检测并记录好各项数值。若NF‑κB活化水平越高则该待测嗜肺军团菌毒力越强；若NF‑κB活化水平越低则该待测嗜肺军团菌毒力越弱。本发明专利技术提供的方法能够更加准确的反应军团菌在宿主体内的真实的毒力，具有更大的临床意义和参考价值，并对嗜肺军团菌的预防和控制有积极影响。

【技术实现步骤摘要】
一种检测嗜肺军团菌毒力的方法
本专利技术涉及鉴定嗜肺军团菌毒力强弱的
技术背景军团菌，系需氧革兰氏阴性的球杆菌，长2-20微米，宽0.3-0.9微米。而由军团菌感染所引起的肺炎被命名为军团菌病。到目前为止，共超过70个种的军团菌被发现。所有已经发现的军团菌都被成功的从环境中分离，其中大约有30种与人类呼吸道有关。在所有种类的军团菌中，有大于90％的感染是由嗜肺军团菌(L.pneumophila)引起的。而嗜肺军团菌引起的感染中又有大于90％的感染是由血清1型(L.pneumophilaserogroup1)引起的。军团菌主要是通过感染者吸入含有军团菌的气溶胶造成的。当人吸入含有军团杆菌的气溶胶时，致使军团杆菌有机会侵染肺泡组织和巨噬细胞，引发炎症，导致军团菌病。其它不常见的方式包括误吸入被污染的水、以及直接接触伤口。值得注意的是，最近在葡萄牙出现了一例疑似直接在人与人之间传播的病例报道。军团菌的分布非常广泛，分布在几乎所有的自然水环境(如溪水、河流、湖泊、温泉等)、湿润的土壤以及泥沼中。军团菌可以长时间存活在湿润环境中，同时可以耐受0-68℃以及pH为5.0-8.5的条件。另外，由于军团菌可以在加氯消毒的条件下存活，因此可以进入供水系统(如空调的冷却塔、热水系统、淋浴的喷头、水龙头以及换气扇等)，并在条件适宜时进行增殖。军团菌病是一种非典型性肺炎，临床上与肺炎球菌以及其它一些细菌的感染相似，所以鉴别诊断上可能造成混淆。军团病的特征为肺炎伴全身性毒血症症状，严重者出现呼吸衰竭。胸部X线表现在早期为单叶斑片状阴影，继而肺实变，病变迅速发展至多肺叶段，可有肺脓肿形成或少量胸腔积液征。确诊依赖于特异性抗体的检查及在痰、胸腔积液、肺组织活检标本中分离出细菌。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测嗜肺军团菌毒力的方法，包括：(1)培养待测嗜肺军团菌菌株；(2)培养HEK293T细胞；(3)完成步骤2，24h后，PEI转染HEK293T细胞，在200ul无血清的DMEM培养基中加入200ngNF-κB报告质粒和10ng海参荧光素酶报告质粒混合均匀，然后在混合液中加入2ulPEI工作液混合均匀，室温静置10min；向混合液中加入550ul的2％FBS/DMEM混合均匀，然后吸掉12孔板中细胞培养液，将混合后的转染工作液全量加入，37℃、3h培养后更换正常的细胞培养基；(4)完成步骤3后，刮取BCYE固体培养基中的菌落接种至一定量BYE液体培养基中，37℃，220rpm培养16h；(5)完成步骤4后，设置分光光度计波长，在600nm波长条件下将测定培养军团菌的OD值，并根据OD值将嗜肺军团菌浓度调至相同，并重悬于培养基中；转染培养24h后使用200ul待测嗜肺军团菌感染HEK293T细胞，感染1h后，用培养基洗细胞后，加培养基培养；(6)完成步骤5，24h后，吸弃24孔板中的培养基，并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一遍，用5xPLB裂解液稀释成1X后裂解细胞10min，期间用PBS配制1xLARII和Stop&GloReagent反应液，最后用GloMaxMulti多功能检测仪检测得嗜肺军团菌毒力数值。若NF-κB活化水平越高则该待测嗜肺军团菌毒力越强；若NF-κB活化水平越低则该待测嗜肺军团菌毒力越弱。嗜肺军团菌毒力强弱的定义如下：将待测嗜肺军团菌感染已转入NF-κB报告系统质粒的HEK293T细胞或稳定表达细胞系，24h培养后用Dual-LuciferaseReporterAssaySystem试剂盒和GloMaxMulti多功能检测仪检测NF-κB活化水平，若待测嗜肺军团菌活化NF-κB水平越高则该军团菌的毒力越强，反之则越弱。嗜肺军团菌毒力强弱的定义具体如下：(1)每组取5只以上A/J小鼠，通过滴鼻感染的方式，每只A/J小鼠感染40ul菌含量为108CFU的待测嗜肺军团菌的菌悬液以进行感染，感染后，如果小鼠的死亡率越高则该军团菌的毒力越强，反之则越弱。(2)嗜肺军团菌感染A/J小鼠第2-4天，对肺组织进行HE染色，肺组织淋巴细胞浸润及损伤越严重的军团菌株毒力越强，反之则弱。(3)嗜肺军团菌感染A/J小鼠第2天，取外周血检测细胞因子，血清炎性细胞因子分泌越多，待测嗜肺军团菌毒力越强，反之则越弱。与之前的通过体外细胞内生长速度及毒力因子表达情况来判断军团菌毒力的方法相比，本专利技术提供的方法能够更加准确的反应军团菌在宿主体内的真实的毒力。通过我们的研究，军团菌的毒力与其在细胞内的生长速度并不是正相关的关系。通过嗜肺军团菌体外刺激NF-κB信号通路的活化能力鉴定嗜肺军团菌毒力的强弱，具有更大的临床意义和参考价值，并对嗜肺军团菌的预防和控制有积极影响。附图说明图1嗜肺军团菌体外刺激NF-κB活化水平结果图。图2嗜肺军团菌感染A/J小鼠体重变化图。图3嗜肺军团菌感染A/J小鼠生存率结果图。图4嗜肺军团菌感染A/J小鼠第2天的肺组织病理切片结果图。图5嗜肺军团菌感染A/J小鼠第2天的血清细胞因子分泌图。图6嗜肺军团菌体外刺激NF-κB活化水平结果图。图7嗜肺军团菌感染A/J小鼠体重变化图。图8嗜肺军团菌感染A/J小鼠生存率结果图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。BCYE固体培养基：碳粉12.5g溶解到ddH2O中定容至450ml，在121℃下高压灭菌30min；待温度降至50℃左右时，将50ml已灭菌的ddH2O溶解军团菌添加剂，在无菌的条件下将两者混匀倒入培养皿。BYE液体培养基：称取5gACES、5gYESTEXTRACT溶解到400mlddH2O中，用KOH调PH至6.9，定容至450ml，121℃灭菌30min。待温度降至50℃左右时，将50ml已灭菌的ddH2O溶解军团菌添加剂，在无菌的条件下将两者混匀后分装到50ml离心管中。HEK293T细胞系：购自ATCC公司，货号为CRL-3216。Dual-LuciferaseReportAssaySystem：购自Promega公司，货号为E1901。完全DMEM细胞培养基：500毫升DMEM培养基(上海源培生物技术有限公司)中加入10％的胎牛血清、10毫摩尔每升的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，100微摩尔每升的非必需氨基酸、2毫摩尔每升的L-谷氨酰胺、50毫克的青霉素及50个单位的链霉素(均购自Gibco)。磷酸盐缓冲液(PBS)：8.768克氯化钠，5.473克十二水合磷酸氢二钠，0.3406克二水合磷酸二氢钠，加纯水定容至1升，将PH值调为7.2-7.4，高温高压灭菌。A/J小鼠模型：购买于南京大学南京生物医药研究院，小鼠周龄均在5-7周。嗜肺军团菌测量吸光度所使用的分光光度计的生产厂家为尤尼柯(上海)仪器有限公司，型号为UV-2600。双荧光检测所用的发光检测仪的生产厂家为Promega公司，型号为E6080。LEGENDplexMouseInflammationPanel：购自BioLegend公司，货号为740118。A/J小鼠血清细胞因子检测所用的流式细胞仪的生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测嗜肺军团菌毒力的方法，其特征在于，包括：(1)培养待测嗜肺军团菌菌株；(2)培养HEK293T细胞；(3)完成步骤2，24h后，PEI转染HEK 293T细胞，在200ul无血清的DMEM培养基中加入200ng NF‑κB报告质粒和10ng海参荧光素酶报告质粒混合均匀，然后在混合液中加入2ul PEI工作液混合均匀，室温静置10min；向混合液中加入550ul的2％FBS/DMEM混合均匀，然后吸掉12孔板中细胞培养液，将混合后的转染工作液全量加入，37℃、3h培养后更换正常的细胞培养基；(4)完成步骤3后，刮取BCYE固体培养基中的菌落接种至一定量BYE液体培养基中，37℃，220rpm培养16h；(5)完成步骤4后，设置分光光度计波长，在600nm波长条件下将测定培养军团菌的OD值，并根据OD值将嗜肺军团菌浓度调至相同，并重悬于培养基中；转染培养24h后使用200ul待测嗜肺军团菌感染HEK 293T细胞，感染1h后，用培养基洗细胞后，加培养基培养；(6)完成步骤5，24h后，吸弃24孔板中的培养基，并用PBS洗一遍，用5x PLB裂解液稀释成1X后裂解细胞10min，期间用PBS配制1x LARII和Stop&Glo Reagent反应液，最后用GloMax Multi多功能检测仪检测并记录好分别在萤火虫荧光素酶作用下发光值及海参荧光素酶作用下发光值数值；(7)计算萤火虫荧光素酶作用下发光值与海参荧光素酶作用下发光值数值的相对发光值，进而得到相对发光值与对照组发光值平均值的相对发光增长倍数值。...

【技术特征摘要】
1.一种检测嗜肺军团菌毒力的方法，其特征在于，包括：(1)培养待测嗜肺军团菌菌株；(2)培养HEK293T细胞；(3)完成步骤2，24h后，PEI转染HEK293T细胞，在200ul无血清的DMEM培养基中加入200ngNF-κB报告质粒和10ng海参荧光素酶报告质粒混合均匀，然后在混合液中加入2ulPEI工作液混合均匀，室温静置10min；向混合液中加入550ul的2％FBS/DMEM混合均匀，然后吸掉12孔板中细胞培养液，将混合后的转染工作液全量加入，37℃、3h培养后更换正常的细胞培养基；(4)完成步骤3后，刮取BCYE固体培养基中的菌落接种至一定量BYE液体培养基中，37℃，220rpm培养16h；(5)完成步骤4后，设置分光光度计波长，在600nm波长条件下将测定培养军团菌的OD值，并根据OD值将嗜肺军团菌浓度调至相同，并重悬于培养基中；转染培养24h后使用200ul待测嗜肺军团菌感染HEK293T细胞，感染1h后，用培养基洗细胞后，加培养基培养；(6)完成步骤5，24h后，吸弃24孔板中的培养基，并用PBS洗一遍，用5xPLB裂解液稀释成1X后裂解细胞10min，期间用PBS配制1xLARII和Stop&GloReagent反应液，最后用GloMaxMulti多功能检测仪检测并记录好分别在萤火虫荧光素酶作用...

【专利技术属性】
技术研发人员：方敏，王浩宇，段学锋，秦天，卢娇，姜威，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，安徽大学，中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京,11