一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法技术

本发明专利技术公开了一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法。具体而言，本发明专利技术的方法包括下列步骤：1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；2）设计并合成引物；3）获得病毒基因组S1至S10片段的cDNA；4）对cDNA进行PCR扩增；5）将扩增产物进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得重组质粒；6）将重组质粒进行酶切、线性化；以及7）将线性化质粒等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染表达T7 RNA聚合酶的宿主细胞，进而获得体外构建的家蚕质型多角体病毒。本发明专利技术的一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法不但对家蚕质型多角体病毒基因组各片段的功能研究有促进作用，为体外获取家蚕质型多角体病毒提供新方法，而且也可以为构建重组质型多角体病毒生物杀虫剂的研发提供理论指导和技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法
本专利技术属于病毒基因工程领域，具体涉及一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法。
技术介绍
呼肠孤病毒科（Reoviridae）病毒是一类双链RNA（dsRNA）病毒，能感染多种动物、植物以及真菌等宿主。质型多角体病毒（Cytoplasmicpolyhedrosisvirus，简称CPVs）在分类上属于呼肠孤病毒科质型多角体病毒属（Cypovirus），其基因组通常由9至11个分子量不同的dsRNA片段组成。CPVs能感染属于鳞翅目（Lepidoptera）、膜翅目（Hymenoptera）和鞘翅目（Coleoptera）等的农林害虫，是一种极具开发潜力的生物杀虫剂。但因技术上的瓶颈，至今还没有通过基因重组获得的重组质型多角体病毒杀虫剂。根据CPVs基因组dsRNA电泳时的迁移模式的差异，CPVs可分为20种不同的类型。家蚕质型多角体病毒（Bombyxmoricytoplasmicpolyhedrosisvirus，BmCPV）是CPV1型中的典型种，能特异性地感染家蚕中肠柱状细胞，导致家蚕发生质型多角体病（又称中肠型脓病），进而引起养蚕歉收。家蚕质型多角体病毒基因组由S1至S10共计10个dsRNA片段组成，各个片段的序列业已明确。通常，获取质型多角体病毒的方法是从自然发生的感染质型多角体病毒的宿主或人工感染的患质型多角体病的宿主或培养细胞中提取，但这种方法必须利用质型多角体病毒的天然宿主或敏感细胞。另外，质型多角体病毒的基因组为分节段的双链RNA病毒，利用常规的遗传操作技术难以对其基因组进行改造，进而获得重组病毒，从而导致CPVs基因组各片段的功能研究进展缓慢，也无法获得重组CPVs杀虫剂。现有技术公开了一种家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其最基本的特征在于将体外转录获得的S1至S10片段的RNA转染家蚕细胞，待细胞发病后，即可获得病毒；也公开了一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其主要技术特征是用红色荧光蛋白基因的编码序列替代S10片段中的多角体蛋白基因的开放读码框，然后利用现有家蚕质型多角体病毒的体外构建方法获得表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒。现有技术方案均需利用体外转录技术，由于技术上的瓶颈，体外转录往往有时难以获得序列较长的完整RNA分子，再加RNA分子易降解，从而影响获取病毒的效率。而对于某些病毒通过细胞转染体外转录获得的病毒RNA也不能体外拯救出病毒。因此，开发新型家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，不但可为体外获取家蚕质型多角体病毒提供新方法，而且也可以为构建重组CPVs生物杀虫剂的研发提供理论指导和技术支撑。
技术实现思路
针对上述情况，本专利技术的目的在于提供一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，相比较现有技术省略了体外转录步骤，高效成功的构建家蚕质型多角体病毒，取得了意想不到的技术效果。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下所述：一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其包括下列步骤：（1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；（2）根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列，设计并合成10对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的编号情况如下：引物PS1F对应SEQIDNO:1，引物PS1R对应SEQIDNO:2，引物PS2F对应SEQIDNO:3，引物PS2R对应SEQIDNO:4，引物PS3F对应SEQIDNO:5，引物PS3R对应SEQIDNO:6，引物PS4F对应SEQIDNO:7，引物PS4R对应SEQIDNO:8，引物PS5F对应SEQIDNO:9，引物PS5R对应SEQIDNO:10，引物PS6F对应SEQIDNO:11，引物PS6R对应SEQIDNO:12，引物PS7F对应SEQIDNO:13，引物PS7R对应SEQIDNO:14，引物PS8F对应SEQIDNO:15，引物PS8R对应SEQIDNO:16，引物PS9F对应SEQIDNO:17，引物PS9R对应SEQIDNO:18，引物PS10F对应SEQIDNO:19，引物PS10R对应SEQIDNO:20，各个引物的序列如下所示：SEQIDNO:1：5'-TTCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGCTAAGTAAAGTGTATGTTTATACC-3'；SEQIDNO:2：5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTCGTGTATG-3'；SEQIDNO:3：5'-TTCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGCTAAGTAAGAGCAGCACTTGTACG-3'；SEQIDNO:4：5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTGAACAGCGTA-3'；SEQIDNO:5：5'-TTCGAGCTCTAATACGACTCACTATAGCTAAGTAAAGACACATGACGAGAAACTAATGTAGTAGGAAAAGATGGAAATAAATAGAGCTGA-3'；SEQIDNO:6：5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTCGACACATGTTCATGCTCCACGCATGCCAGCATATAGGCTCCTCATCGTGGATGCATAACG-3'；SEQIDNO:7：5'-TTCGGTACCTAATACGACTCACTATAGCTAAGTAATTTCCACCATGTGGC-3'；SEQIDNO:8：5'-TATCCGCGGGGCTAACGTTTCCCACCGC-3'；SEQIDNO:9：5'-TCGAATTTAAAGCTTGGTACCTAATACGACTCACTATAGCTAAGTAATTTCCCCTTACC-3'；SEQIDNO:10：5'-ATAGGCTTACCTTCGAACCGCGGCTAACCATCTCCCCGTG-3'；SEQIDNO:11：5'-TTCGGTACCTAATACGACTCACTATAGCTAAGTAAGATTCCGTAATATCC-3'；SEQIDNO:12：5'-TATCCGCGGGGCTAACGTTGACTCCGC-3'；SEQIDNO:13：5'-TTCGGTACCTAATACGACTCACTATAGCTAAGTAATTTGGTCATAACAGC-3'；SEQIDNO:14：5'-GGCTCTAGAGGCTAACGTTTGGTCACTCCG-3'；SEQIDNO:15：5'-TTCGGTACCTAATACGACTCACTATAGCTAAGTAAAGTCCAGTACTAG-3'；SEQIDNO:16：5'-TATCCGCGGGGCTAACGGTAGTCCGCCGC-3'；SEQIDNO:17：5'-TTCGGTACCTAATACGACTCACTATAGCTAAGTAAATCCCAGGCGTAAACCG-3'；SEQIDNO:18：5'-TATCCGCGGGGCTAACGACC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其包括下列步骤：1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；2）根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列，设计并合成10对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的编号情况如下：引物PS1F对应SEQ ID NO:1，引物PS1R对应SEQ ID NO:2，引物PS2F对应SEQ ID NO:3，引物PS2R对应SEQ ID NO:4，引物PS3F对应SEQ ID NO:5，引物PS3R对应SEQ ID NO:6，引物PS4F对应SEQ ID NO:7，引物PS4R对应SEQ ID NO:8，引物PS5F对应SEQ ID NO:9，引物PS5R对应SEQ ID NO:10，引物PS6F对应SEQ ID NO:11，引物PS6R对应SEQ ID NO:12，引物PS7F对应SEQ ID NO:13，引物PS7R对应SEQ ID NO:14，引物PS8F对应SEQ ID NO:15，引物PS8R对应SEQ ID NO:16，引物PS9F对应SEQ ID NO:17，引物PS9R对应SEQ ID NO:18，引物PS10F对应SEQ ID NO:19，引物PS10R对应SEQ ID NO:20，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20所示；3）获得S1至S10片段的cDNA；4）分别以步骤3）中获得的S1至S10片段的cDNA为模板，对应使用步骤2）中合成的10对引物进行PCR扩增，获得S1至S10片段全长cDNA的扩增产物；5）将步骤4）中获得的S1至S10片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有S1至S10片段全长cDNA的重组质粒pT‑S1、pT‑S2、pT‑S3、pT‑S4、pT‑S5、pT‑S6、pT‑S7、pT‑S8、pT‑S9、pT‑S10，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S9片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S10片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；6）将步骤5）中获得的pT‑S1至pT‑S10重组质粒分别使用限制性内切酶进行酶切，获得pT‑S1至pT‑S10的线性化质粒，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：重组质粒pT‑S1用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S2用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S3用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S4用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S5用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S6用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S7用XbaI进行酶切；重组质粒pT‑S8用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S9用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S10用SacII进行酶切；7）将步骤6）中获得的pT‑S1至pT‑S10的线性化质粒等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染表达T7 RNA聚合酶的宿主细胞，待观察到细胞质内形成多角体时，收集细胞并破碎，离心纯化，获得体外构建的家蚕质型多角体病毒。...

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其包括下列步骤：1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；2）根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列，设计并合成10对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的编号情况如下：引物PS1F对应SEQIDNO:1，引物PS1R对应SEQIDNO:2，引物PS2F对应SEQIDNO:3，引物PS2R对应SEQIDNO:4，引物PS3F对应SEQIDNO:5，引物PS3R对应SEQIDNO:6，引物PS4F对应SEQIDNO:7，引物PS4R对应SEQIDNO:8，引物PS5F对应SEQIDNO:9，引物PS5R对应SEQIDNO:10，引物PS6F对应SEQIDNO:11，引物PS6R对应SEQIDNO:12，引物PS7F对应SEQIDNO:13，引物PS7R对应SEQIDNO:14，引物PS8F对应SEQIDNO:15，引物PS8R对应SEQIDNO:16，引物PS9F对应SEQIDNO:17，引物PS9R对应SEQIDNO:18，引物PS10F对应SEQIDNO:19，引物PS10R对应SEQIDNO:20，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1至SEQIDNO:20所示；3）获得S1至S10片段的cDNA；4）分别以步骤3）中获得的S1至S10片段的cDNA为模板，对应使用步骤2）中合成的10对引物进行PCR扩增，获得S1至S10片段全长cDNA的扩增产物；5）将步骤4）中获得的S1至S10片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有S1至S10片段全长cDNA的重组质粒pT-S1、pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和Sa...

【专利技术属性】
技术研发人员：贡成良，曹广力，薛仁宇，胡小龙，余蕾，冯永杰，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32