一种免疫传感器及其制备与应用制造技术

本发明专利技术提供一种免疫传感器及其制备与应用，其中包括一对基于邻位连接的核酸适配体亲和探针Apt‑P1和Apt‑P2，所述Apt‑P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Apt‑P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术的邻位连接探针通过内部碱基转移可以增加反应速度，降低背景信号，在该设计下信噪比最高。核酸适配体替代抗体作为亲和探针，节省了常规抗体所需成本，简化了常规抗体制备及储存所需的苛刻条件。本发明专利技术通过改良的邻位连接诱导的熵驱动信号放大策略，实现了对PDGF‑BB的高灵敏及高特异性检测。该检测方法简便，无需昂贵仪器，只需常规荧光分光光度计便可检测，降低检测成本。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫传感器及其制备与应用
本专利技术涉及传感器领域，尤其涉及一种免疫传感器及其制备与应用。
技术介绍
血小板衍生因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)是一种多肽生长因子，不仅可以促进血管生成，还可促进多种细胞有丝分裂，主要有3种存在形式(PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB)。其中PDGF-BB可与PDGF受体α和β高亲和力结合，其促增殖作用相比于其他亚型更强。研究证实，PDGF-BB可以促进多种结缔组织细胞的生长与分化，其与多种疾病相关，如动脉粥样硬化、纤维化病症、恶性肿瘤等。因此，PDGF-BB蛋白作为一类经典的生物标志物，对临床分子诊断、疾病的治疗预后具有极其重要的作用。目前，常规的蛋白检测方法主要基于相应的生物抗体，有酶联免疫法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、Westernblot及免疫PCR(Immuno-polymerasechainreaction,ImmunoPCR)。虽然这些方法能在一定程度上满足临床检测及诊断所需，但是它们都存在一定的不足，如均需要抗体易失活、价格昂贵、操作步骤繁琐、耗时长。因此，发展一种简单、快速、实用、灵敏的蛋白检测新技术对于阐明肿瘤发生发展的机制，早期诊断和早期治疗及探寻新的肿瘤治疗靶点具有重要价值。近年来，随着DNA碱基互补配对杂交的不断深入研究，DNA纳米技术在多方面都展现出其不可比拟的优势，如逻辑门操作、生物标志物的检测，以及临床疾病的早期诊断。相比于传统的蛋白检测技术，基于DNA纳米技术的蛋白检测新方法具有反应过程可控、易于合成、快速、稳定性好、灵敏度高等优点。邻位连接技术是一种基于DNA邻位自组装的新方法，其通过一对核酸适配体亲和探针特异性识别靶蛋白，将蛋白的检测转换为核酸检测，具有简便、均相、价廉等优点。研究证明，邻位连接技术可级联各种信号放大策略，如：杂交链反应(hybridizationchainreaction,HCR)、催化茎环自组装(catalytichairpinassembly,CHA)、toehold介导的链置换反应(toehold-mediatedstranddisplacementreaction,TSDR)、熵驱动(Entropy-drivenamplificationcircuits，EDC)，从而保证了蛋白的高灵敏、高特异性检测。其中，熵驱动是链替代置换反应发展史上的一个里程碑，其不需要设计复杂的茎环探针，具有简便、快速、低背景、高信噪比等特点。但是，目前已发展的邻位连接技术由于存在不可预期的中间反应复合体，因此，其存在不依赖于toehold介导的信号泄露。同时，由于邻位连接的转化速率主要依赖于亲和探针识别靶蛋白形成的缺口引物与信号探针之间的链迁移速度，因此，缺口引物的设计对邻位转化速率至关重要。然而，现有的邻位连接技术大多存在反应速率慢、背景信号大等缺点，亟待发展新方法以弥补现有技术的不足，为蛋白的高灵敏、高特异性检测提供新思路。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种免疫传感器及其制备与应用，用于解决现有技术中PDGF-BB蛋白检测时反应速率慢、背景信号大等问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种用于检测PDGF-BB蛋白的邻位连接核酸适配体亲和探针，包括Apt-P1和Apt-P2，所述Apt-P1的核苷酸序列为(SEQIDNO.1)，所述Apt-P2的核苷酸序列为(SEQIDNO.2)。在本专利技术的一些实施例中，所述Apt-P1的1域(单直下划线标记)碱基数为3～6nt。在本专利技术的一些实施例中，所述Apt-P1的1域碱基数为5nt。在本专利技术的一些实施例中，所述Apt-P2的3域(双波浪下划线标记)3’端错配或转移碱基1nt至Apt-P2，优选为转移碱基1nt。邻位连接探针通过内部碱基转移可以增加反应速度，降低背景信号，在该设计下信噪比最高。核酸适配体替代抗体作为亲和探针，节省了常规抗体所需成本，简化了常规抗体制备及储存所需的苛刻条件。所述检测方法简便，无需昂贵仪器，只需常规荧光分光光度计便可检测。本专利技术第二方面提供含有所述核酸适配体亲和探针的蛋白免疫传感器，该传感器通过引入拆分核酸适配体以实现对靶蛋白的高特异性的识别，通过邻位连接(PLA)引发的熵驱动信号放大策略实现对痕量蛋白高灵敏的检测。在本专利技术的一些实施例中，所述蛋白免疫传感器还包括熵信标复合物。在本专利技术的一些实施例中，所述熵信标复合物包括reporter链、quencher链、byproduct链，所述reporter链的核苷酸序列为5’-FAM-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGG-3’(SEQIDNO.3)，所述quencher链的核苷酸序列为5’-GTTGGAATTGGGAGTAAGGGCAGGGCCGTAAGTTAGTTGGAGACGTAGG-BHQ1-3’(SEQIDNO.4)，所述byproduct链的核苷酸序列为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTCCCTGCCCTTACTCCC-3’(SEQIDNO.5)。在本专利技术的一些实施例中，所述熵信标复合物中reporter链、quencher链、byproduct链的摩尔比为1:1:1.2。在本专利技术的一些实施例中，所述燃烧链的核苷酸序列为5’-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGGCCCTGCCCTTACTCCCAAT-3’(SEQIDNO.6)。本专利技术第三方面提供上述核酸适配体亲和探针或蛋白免疫传感器在检测PDGF-BB蛋白中的应用。本专利技术第四方面提供一种采用上述核酸适配体亲和探针检测PDGF-BB蛋白的方法，包括以下步骤：1)制备熵信标复合物：将Reporter链、Byproduct链与Quencher链混合，变性处理后，缓慢冷却至室温，室温下杂交，制得所述熵信标复合物。2)邻位连接：将核酸适配体亲和探针Apt-P1与Apt-P2变性处理，缓慢冷却至室温，加入靶蛋白，在反应体系内孵育，形成邻位连接复合物；3)将所述邻位连接复合物、熵信标复合物、燃烧链混合反应，待反应完毕，用荧光分光光度计检测其荧光强度。其中，步骤1)与步骤2)无先后顺序之分，可同时进行，也可分先后进行。该方法通过核酸适配体亲和探针特异性识别靶目标，通过邻位连接形成有缺口的Trigger，该Trigger通过Toehold识别熵信标复合物(TDC)并启动熵驱动信号放大，从而使荧光信号输出不断增强。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤1)中，所述Reporter链、Byproduct链、Quencher链的摩尔比为1:1:1.2。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤1)中，混合物在1×TAE/Mg2+缓冲液中通过程序控温形成杂交复合物，所述Reporter、Byproduct链、Quencher链在体系中的终浓度为10μM。此处μM即指μmol/L。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤2)中，所述核酸适配体亲和探针Apt-P1与Apt-P2的摩尔比为1:1。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤2)中，孵育温度为4-50℃。在本专利技术的一些实施例中，所述步骤2)中，孵育温度为25-50℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测PDGF‑BB蛋白的邻位连接核酸适配体亲和探针，其特征在于：包括Apt‑P1和Apt‑P2，所述Apt‑P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Apt‑P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测PDGF-BB蛋白的邻位连接核酸适配体亲和探针，其特征在于：包括Apt-P1和Apt-P2，所述Apt-P1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述Apt-P2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的邻位连接核酸适配体亲和探针，其特征在于：所述Apt-P1的1域碱基数为3～6nt，优选为5nt。3.根据权利要求1所述的邻位连接核酸适配体亲和探针，其特征在于：所述Apt-P2的3*域3’端错配或转移碱基1nt，优选为转移碱基1nt。4.含有权利要求1-3任意一项所述邻位连接核酸适配体亲和探针的蛋白免疫传感器。5.根据权利要求4所述的蛋白免疫传感器，其特征在于：所述蛋白免疫传感器还包括熵信标复合物。6.根据权利要求4所述的蛋白免疫传感器，其特征在于：所述熵信标复合物包括reporter链、quencher链、byproduct链；所述reporter链的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述quencher链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述byproduct链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。7.根据权利要求4所述的蛋白免疫传感器，其特征在于：所述熵信标复合物中reporter链、quencher链、byproduct链的摩尔比为1:1:1.2。8.根据权利要求1-3任意一项所述邻位连接核酸适配体亲和探针或权利要求4-7任意一项所述蛋白免疫传感器在检测PDGF-BB蛋白中的应用。9.一种采用权利要求1-3任意一项所述邻位连...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丹丹，陈维贤，丁世家，李新民，莫菲，王玎，李朴，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50