改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体及其固定化酶和制备方法技术

一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体及其固定化酶和制备方法，属于固定化酶制备技术领域。改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，其为改性膨胀蛭石与壳聚糖通过硅烷偶联剂偶联得到的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体。改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶，为改性膨胀蛭石与壳聚糖通过硅烷偶联剂偶联制备成复合载体，再通过交联剂戊二醛的醛基分别与复合载体中壳聚糖氨基及酶的氨基发生Schiff反应，形成共价键，将酶固定在复合载体上。该方法选用的无机材料膨胀蛭石与有机材料壳聚糖价廉易得，生产工艺简单，生产成本低，酶活力回收率高，重复利用率高，可为脂肪酶在有机合成工业、食品工业等方面应用提供潜在支撑。

【技术实现步骤摘要】
改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体及其固定化酶和制备方法
本专利技术公开了一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体及其固定化酶和制备方法，属于固定化酶制备工艺

技术介绍
脂肪酶，即三酰基甘油水解酶(EC3.1.1.3)，普遍存在于动物、植物及微生物中。其可以催化天然底物油脂进行酯交换反应和水解反应，生成脂肪酸、甘油、甘油单酯或二酯，能在油水界面催化酯水解、醇解、酯合成、内酯合成、酯交换、多肽合成及立体异构体拆分等多种有机反应。因此，脂肪酶在有机合成工业、造纸工业、食品工业、污剂工业及生物表面活性剂工业中都有广泛的应用，是目前催化剂研究热点之一。而脂肪酶成本高且易失活是制约其应用的主要障碍。脂肪酶，根据其应用形式可分为游离酶与固定化酶。固定化酶是指通过物理或化学方法结合在固相载体上的酶，使本来分散于流动液相与底物均相混合的游离酶成为与底物异相接触的固定相，从而使酶的催化反应被限制在固定相上进行。游离酶在应用中存在稳定性较差、产物分离纯化困难、不能反复利用等缺点；而固定化酶对热的稳定性提高、耐酸耐碱、对蛋白酶的抵抗性增强、对变性剂及抑制剂的耐受性提高、能够实现酶与产物的分离、可反复使用降低成本，便于自动化生产。在酶的固定化技术中，载体材料的形状、活性基团及微环境等因素，均可能影响载体与酶的亲和力及固定化酶的活力、稳定性、重复使用性等。蛭石是一种具有层状硅酸盐结构的天然黏土矿物，通常是黑云母经热水溶液蚀变作用或风化而来，在此过程中，云母中的钾离子并非简单地被其他水化阳离子所交换，而是伴随着化学结构的变化，为含镁，铁质铝硅酸盐的次生变质矿物。蛭石具有天然的多孔道结构、高比表面积及吸附性，机械刚性和热稳定性好，能够防止微生物的降解作用，环境友好且价格低廉，符合作为固定化酶载体的基本条件；若对蛭石进行适当改性，还能提高其吸附能力等性能。壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰反应而得到的产物，其学名为β-1,4-聚-葡萄糖胺，一些双功能试剂能够与壳聚糖和蛋白类酶分子上的氨基发生Schiff反应，将酶与壳聚糖交联在一起。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决游离脂肪酶在应用中存在稳定性较差、产物分离纯化困难、不能反复利用、成本高等缺点，目前的固定化脂肪酶生产工艺成本高、酶活力回收率低、重复利用率低等不足之处，提供一种兼具无机/有机材料优点的复合载体固定化脂肪酶的方法。该方法是将无机载体改性膨胀蛭石与有机载体虾外壳壳聚糖通过硅烷偶联剂偶联制备成复合载体，再通过交联剂戊二醛的醛基分别与复合载体中壳聚糖氨基及黑曲霉脂肪酶的氨基发生Schiff反应，形成共价键，将酶固定在复合载体上。本专利技术选用的无机材料膨胀蛭石与有机材料壳聚糖价廉易得，生产工艺简单，生产成本低，酶活力回收率高，重复利用率高，可为脂肪酶在有机合成工业、食品工业等方面应用提供潜在支撑。本专利技术为解决以上问题所采用的技术方案为：本专利技术的一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，包括以下步骤：(1)将改性膨胀蛭石放入蒸馏水中，搅拌，溶胀，得到改性膨胀蛭石悬浊液；其中，按固液比，改性膨胀蛭石：蒸馏水＝(8g～12g)：(160mL～240mL)；(2)将壳聚糖溶于质量浓度为5％～15％醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液；其中，按固液比，壳聚糖：质量浓度为5％～15％醋酸水溶液＝(4g～6g)：(240mL～360mL)；(3)将壳聚糖醋酸溶液缓慢滴入改性膨胀蛭石悬浊液中，滴入速度为1mL/min～5mL/min，再加入质量浓度为0.3％～0.7％的硅烷偶联剂乙醇溶液，振荡，使改性膨胀蛭石和壳聚糖偶联，得到改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，烘干，备用，得到干燥后的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体；其中，按固液比，改性膨胀蛭石：壳聚糖：质量浓度为0.3％～0.7％的硅烷偶联剂乙醇溶液硅烷偶联剂＝8g～12g：4g～6g：40～60mL；所述的步骤(1)中，所述的改性膨胀蛭石为用盐酸改性的膨胀蛭石，其作用在于除杂增加膨胀蛭石的比表面积。所述的步骤(1)中，所述的搅拌为15℃～40℃搅拌2h～5h。所述的步骤(2)中，所述的壳聚糖为虾外壳提取、蟹外壳提取或市购中的一种方法获取或几种方法获取。所述的步骤(3)中，所述的硅烷偶联剂为硅烷偶联剂kh570或硅烷偶联剂kh550中的一种。所述的步骤(3)中，所述的振荡，振荡频率为100r/min～300r/min，振荡温度为20～30℃，振荡时间为2h～5h。所述的步骤(3)中，所述的烘干为100℃～130℃烘干5h～8h。本专利技术的一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，采用上述制备方法制得，其为改性膨胀蛭石与壳聚糖偶联得到的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体。本专利技术的一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备方法，包括以下步骤：步骤1：修饰复合载体将干燥后的改性蛭石/壳聚糖复合载体加入质量浓度为0.5％～2％的戊二醛水溶液中，振荡反应，使戊二醛中的醛基与复合载体中的壳聚糖的氨基发生Schiff反应，形成共价键，得到戊二醛修饰的复合载体；其中，按固液比，干燥后的改性蛭石/壳聚糖复合载体：质量浓度为0.5％～2％的戊二醛水溶液＝(0.2～1.2)g：25mL～100mL；步骤2：酶的固定化将质量浓度为0.5％～2％酶的磷酸缓冲液，加入戊二醛修饰的复合载体中，使得酶的氨基与戊二醛的醛基发生Schiff反应，形成共价键，得到固定化酶；其中，按体积比，质量浓度为0.5％～2％酶的磷酸缓冲液：戊二醛修饰的复合载体＝1:4～6步骤3：后处理固定化完成后，过滤，将过滤固体用磷酸盐缓冲溶液洗涤，至上清液中检测不到酶，得到改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶。所述的步骤1中，所述的Schiff反应，其反应工艺为：振荡频率为100r/min～300r/min，温度为20℃～40℃，时间为1～3h。所述的步骤3中，所述的振荡固定化的工艺为：22℃～42℃下振荡固定化1～6h。本专利技术的一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶，采用上述方法制得。本专利技术的一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶，为改性膨胀蛭石与壳聚糖通过硅烷偶联剂偶联制备成复合载体，再通过交联剂戊二醛的醛基分别与复合载体中壳聚糖氨基及酶的氨基发生Schiff反应，形成共价键，将酶固定在复合载体上。本专利技术的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体及其固定化酶和制备方法，其有益效果为：本专利技术选用的无机材料——改性膨胀蛭石与有机材料——虾外壳壳聚糖，均价廉易得，合成的复合载体兼具无机与有机载体的优点，生产工艺简单，生产成本较低，酶活力回收率较高(可达到91.53％)，重复使用稳定性较好，可为其在有机合成工业、食品工业、污剂工业及生物表面活性剂工业中的应用提供技术支撑。本专利技术改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体固定化酶的制备过程中，采用先将戊二醛和改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体进行Schiff反应，再进行酶的固定化，使酶与复合载体上的戊二醛醛基通过共价键连接，以保证后期使用过程中，酶不易脱落，能够反复利用。而现有的一些技术是将载体和酶混合，再加入交联剂的反应方法(一锅法)，这种方法容易产生聚合酶的问题，并且产生的聚合酶大颗粒是吸附在载体上，是一种物理吸附，在后期在使用过程中，酶极容易脱落，本专利技术能有效的避免这一缺点。具体实施方式下面结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，其特征在于，该复合载体是改性膨胀蛭石与壳聚糖偶联得到的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体。

【技术特征摘要】
1.一种改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，其特征在于，该复合载体是改性膨胀蛭石与壳聚糖偶联得到的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体。2.权利要求1所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将改性膨胀蛭石放入蒸馏水中，搅拌，溶胀，得到改性膨胀蛭石悬浊液；其中，按固液比，改性膨胀蛭石：蒸馏水＝(8g～12g)：(160mL～240mL)；(2)将壳聚糖溶于质量浓度为5％～15％醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液；其中，按固液比，壳聚糖：质量浓度为5％～15％醋酸水溶液＝(4g～6g)：(240mL～360mL)；(3)将壳聚糖醋酸溶液缓慢滴入改性膨胀蛭石悬浊液中，滴入速度为1mL/min～5mL/min，再加入质量浓度为0.3％～0.7％的硅烷偶联剂乙醇溶液，振荡，使改性膨胀蛭石和壳聚糖偶联，得到改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体，烘干，备用，得到干燥后的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体；其中，按固液比，改性膨胀蛭石：壳聚糖：质量浓度为0.3％～0.7％的硅烷偶联剂乙醇溶液硅烷偶联剂＝8g～12g：4g～6g：40～60mL。3.如权利要求2所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，所述的改性膨胀蛭石为用盐酸改性的膨胀蛭石。4.如权利要求2所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，所述的搅拌为15℃～40℃搅拌2h～5h。5.如权利要求2所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，所述的硅烷偶联剂为硅烷偶联剂kh570或硅烷偶联剂kh550中的一种。6.如权利要求2所述的改性膨胀蛭石/壳聚糖复合载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，所述的振荡...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄静，梁密，黄媛，闫晗，
申请(专利权)人：辽宁工程技术大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21