表达天维菌素B的重组微生物、制备方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种单组分天维菌素B基因工程菌及其制备方法。该基因工程菌是在天维菌素产生菌Streptomyces avermitilis MA220的基因组中将milA1基因的AT0结构域置换成红霉素合成基因簇的AT0结构域而获得。所述天维菌素B工程菌发酵后，只产生单一组分的天维菌素B。

【技术实现步骤摘要】
表达天维菌素B的重组微生物、制备方法及其用途
本专利技术属于基因工程及微生物发酵领域，具体涉及表达天维菌素B的重组微生物及其制备方法，以及利用所述重组微生物生产天维菌素B的方法。
技术介绍
天维菌素类化合物是从阿维菌素产生菌除虫链霉菌MA-4680出发进行基因改造，结合阿维菌素、伊维菌素和米尔贝霉素的化学结构和各自生物学特性(抗虫活性、抗虫谱以及生物毒性)上的优势，设计得到的一组十六元大环内酯类新化合物(JunHuang,An-LiangChen,HuiZhang,etal.GeneReplacementfortheGenerationofDesignedNovelAvermectinDerivativeswithEnhancedAcaricidalandNematicidalActivities.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,August2015,Volume81,Number16.)。该类化合物具有广谱、高效、无残留毒性，对环境友好等特征。初步的活性试验结果也表明，天维菌素对多种常见害虫，如红蜘蛛、烟粉虱、稻飞虱、蓟马、猪鞭虫等等的抗虫活性要远远高于阿维菌素、伊维菌素、米尔贝霉素、甲维盐等主流农药和兽药，而毒性则低于目前市面上常用的农药和兽药，具有进一步开发成新型高效农药和兽药的潜力。天维菌素类化合物一般包括天维菌素A(TEVA)和天维菌素B(TEVB)，具体结构通式如下：R为CH3时为天维菌素A；R为C2H5时为天维菌素B。专利PCT/CN2015/073960公开了一种天维菌素类化合物的制备方法，其通过失活除虫链霉菌MA4680中的aveD基因，并且用功能性milA1基因替换链霉菌基因组中的aveA1基因从而获得了一种可以生产天维菌素的基因工程菌MA220。但是在其发酵代谢产物中，天维菌素B的含量较低，根据其公开的
技术实现思路
来看，天维菌素A和天维菌素B的比例(质量比)为7:3、8:2或9:1。而天维菌素B组分抗朱砂叶螨、小菜蛾、棉铃虫，松材线虫病，水稻螟虫等农林作物害虫活性要优于组分A，因此有必要开发一种可生产高含量天维菌素B的工程菌种。
技术实现思路
本专利技术的第一方面是提供一种表达天维菌素B的重组链霉菌，其中所述重组链霉菌中的milA1AT0结构域基因编码序列置换成红色糖多孢菌(SaccharopolysporaerythraeaNRRL23338)eryA1中的AT0结构域基因序列。在一个实施方案中，本专利技术的重组链霉菌是将除虫链霉菌MA220中的milA1AT0结构域基因编码序列置换成红色糖多孢菌(SaccharopolysporaerythraeaNRRL23338)eryA1中的AT0结构域基因序列。所述除虫链霉菌MA220可通过专利PCT/CN2015/073960公开的相关方法进行制备。在另一个实施方案中，所述重组链霉菌只表达天维菌素B而不表达天维菌素A。在一个具体实施方案中，所述milA1AT0结构域基因编码序列如SEQIDNO:1所示；所述eryA1AT0结构域基因编码序列如SEQIDNO:3所示；所述置换是通过将DNA片段S导入到除虫链霉菌MA220中，使DNA片段S与出发菌MA220中的milA1基因发生同源重组而完成。本专利技术的第二方面是提供本专利技术的重组链霉菌用于生产天维菌素B的用途。本专利技术的第三个方面是提供一种生产天维菌素B的方法，其包括培养所述重组链霉菌，以及从培养物中回收天维菌素B。本专利技术的第四个方面是提供一种构建所述重组链霉菌的方法，所述方法包括：(1)提供待改造的链霉菌；(2)将所述待改造链霉菌中的milA1AT0结构域基因编码序列置换成红色糖多孢菌(SaccharopolysporaerythraeaNRRL23338)eryA1中的AT0结构域基因序列。在一个实施方案中，所述待改造的链霉菌是除虫链霉菌，优选地是除虫链霉菌MA220。在另一个实施方案中，所述置换是通过将DNA片段S导入到除虫链霉菌MA220中，使DNA片段S与出发菌MA220中的milA1基因发生同源重组而完成。在又一个实施方案中，所述eryA1AT0结构域基因编码片段包含eryA1中完整AT0结构域基因编码序列948bp核苷酸；编码序列如SEQIDNO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。所述milA1AT0结构域基因编码序列如SEQIDNO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。在一个具体的实施方案中，所述DNA片段S，自5’端到3’端分别为同源臂T1、eryA1AT0结构域基因编码片段和同源臂T2；所述同源臂T1和同源臂T2能与milA1基因的相应位置发生同源重组。更具体地来说，所述同源臂T1与milA1基因中AT0结构域的上游序列同源重组；进一步优选地，所述同源臂T1包括milA1基因编码序列5’端306bp核苷酸。所述同源臂T2与milA1基因中AT0结构域的下游序列同源重组；进一步优选地，所述同源臂T2包括milA1基因编码序列中端1360bp核苷酸。在一个优选的实施方案中，所述片段S的序列如SEQIDNO:5所示。同源重组的原理是本领域技术人员已知的。所述DNA片段S分别在同源臂T1和同源臂T2包括milA1AT0基因编码序列的上游和下游序列。当T1、T2与除虫链霉菌MA220的milA1AT0的上下游发生同源重组时，所述DNA片段S将被重组至除虫链霉菌MA220的基因组中，从而使出发菌中milA1AT0被DNA片段S所携带的eryA1AT0置换，使eryA1AT0在构建的基因工程菌中表达。本领域技术人员可以理解，当milA1AT0基因的上游和下游分别被扩增后，需要将二者连接起来以形成完整的DNA片段。通常情况下，本领域技术人员将使用限制性内切酶识别序列来连接两个片段。限制性内切酶的选择、包含限制性内切酶识别序列的引物设计、PCR扩增以及扩增片段的回收和连接等都是本领域技术人员根据所使用的质粒、菌株和实验条件可以选择和判断的。本公开内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个实施方案中所记载的一个或更多个技术特征可以与任意的一个或更多个其它实施方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本公开内容中具体记载一样。通过以上至少一个方面，本专利技术的重组链霉菌可以高效地生产天维菌素B，并且该重组链霉菌并不表达天维菌素A。从而解决了现有技术中现有链霉菌株表达天维菌素B含量过低，生产困难的技术问题。本专利技术的重组链霉菌发酵生产天维菌素B的稳定性好，得率高，较化学合成方法更为环境友好和简单，还极大地节省了生产成本。附图说明下面将结合附图以及进一步的详细说明来举例说明本专利技术。需要指出的是，以下说明仅仅是对本专利技术要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本专利技术的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。图1：用于milA1基因双交换的重组质粒SAT-TUeatTD构建过程示意图；图2：重组质粒SAT-TAT0U的结构及酶切位点示意图；图3：构建的质粒SAT-TAT0U的酶切电泳检测图；其中M是DNALadder(Fermentas#SM033本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达天维菌素B的重组链霉菌，其中所述重组链霉菌中的milA1AT0结构域基因编码序列置换成红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea NRRL23338)eryA1中的AT0结构域基因序列。

【技术特征摘要】
1.一种表达天维菌素B的重组链霉菌，其中所述重组链霉菌中的milA1AT0结构域基因编码序列置换成红色糖多孢菌(SaccharopolysporaerythraeaNRRL23338)eryA1中的AT0结构域基因序列。2.根据权利要求1的重组链霉菌，重组链霉菌是将除虫链霉菌MA220中的milA1AT0结构域基因编码序列置换成红色糖多孢菌(SaccharopolysporaerythraeaNRRL23338)eryA1中的AT0结构域基因序列。3.根据权利要求1或2的重组链霉菌，所述重组链霉菌只表达天维菌素B而不表达天维菌素A。4.根据权利要求1或2的重组链霉菌，所述milA1AT0结构域基因编码序列如SEQIDNO:1所示；所述eryA1AT0结构域基因编码序列如SEQIDNO:3所示。5.权利要求1-4任一项所述的重组链霉菌用于生产天维菌素B的用途。6.一种生产天维菌素B的方法，其包括培养所述权利要求1-4任一项所述重组链霉菌，以及从培养物中回收天维菌素B。7.一种构建权利要求1-4任一项所述重组链霉菌的方法，所述方法包括：(1)提供待改造的链霉菌；(2)将所述待改造链霉菌中的milA1AT0结构域基因编码序列置换成红色糖多孢菌(SaccharopolysporaerythraeaNRRL23338)eryA1中的AT0结构域基因序列。8....

【专利技术属性】
技术研发人员：黄隽，余贞，周亚娜，林甲壇，周小华，李美红，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，台州市劢康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33