本发明专利技术公开了一种抗GPC3蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用，本发明专利技术利用原核表达的GPC3融合蛋白免疫骆驼，提取骆驼脾脏组织中的RNA，以其为模板反转成cDNA，构建到噬菌体外衣壳蛋白的载体上，构建噬菌体展示文库，并计算库容及滴度。然后利用抗原‑抗体亲和性原理，经三轮淘选，从该文库中筛选出与GPC3特异性结合的纳米抗体，进而获得该特异性抗体的基因，构建表达载体，对其进行原核表达、纯化与鉴定，即得到所需要的纳米抗体。
Anti GPC3 protein nano antibody and preparation method and application thereof
The invention discloses a kind of nano-antibody against GPC3 protein and its preparation method and application. The method uses the GPC3 fusion protein expressed in prokaryotic to immunize camels, extracts RNA from camel spleen tissues, uses it as template to reverse into cDNA, constructs the carrier of phage capsid protein, constructs phage display library, and calculates it. Storage capacity and titer. Then using the principle of antigen-antibody affinity, through three rounds of panning, the specific binding nano-antibody to GPC3 was screened out from the library, and then the specific antibody gene was obtained. The expression vector was constructed, and its prokaryotic expression, purification and identification were carried out.
【技术实现步骤摘要】
一种抗GPC3蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种抗GPC3蛋白的纳米抗体，本专利技术还涉及该纳米抗体的制备方法和应用。
技术介绍
肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康。肝癌的治疗手段主要包括肝移植、肿瘤切除及非切除性局部疗法如肝动脉化疗栓塞等。由于肝癌特别是原发性肝癌(HCC)早期易发生转移以及治疗后易复发，因此，寻找一个可以准确判断预后的指标和有效的肝癌治疗靶点具有重要意义。早期诊断和治疗是提高原发性肝细胞癌疗效的关键因素之一。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3，GPC3)作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成员，它参与调控细胞增殖、调控、粘附和迁移等过程。有研究显示GPC3原发性肝癌中特异性高表达，而在成人正常肝组织低表达或不表达。从而提示GPC3对肝癌诊断具有显著的灵敏性和特异性，可作为识别原发性肝癌(HCC)特异性肿瘤标志物。靶向治疗则使分子药物特异性结合到肿瘤细胞的某些特定的作用位点，选择性杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅很少损伤正常组织与细胞，克服了传统治疗存在的弊端，因而肝癌的靶向治疗近年来成为研究的热点。目前肝癌靶向药物主要有两种类型：一种是激酶类抑制剂。如甲苯磺酸索拉非尼。第二种为一种重组的人源化、人鼠嵌合单克隆抗体，如贝伐单抗。这些单抗虽然在晚期肝癌的巩固治疗中显示了一定的作用，但效率低，费用昂贵，限制其广泛应用。目前，研究获得的纳米抗体不仅具有完整功能，而且其与常规抗体相比具有水溶性好，分子量小，组织穿透力强，免疫原性弱，可优先识别受体与配体结合部位等优点。然而，目前尚没有抗GPC3蛋白的纳米抗体及高效的制备方法。
技术实现思路
为了解决上述技术问题的至少一个，本专利技术提供一种抗GPC3蛋白的纳米抗体，该纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。在本专利技术的实施方案中，所述纳米抗体仅由重链组成，在本专利技术的实施方案中，所述纳米抗体的分子量大小为13kD。本专利技术的第二方面提供编码本专利技术第一方面所述纳米抗体的基因，该基因包含SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。本专利技术的第三方面提供一种重组质粒，该质粒包含本专利技术第二方面所述的基因。在本专利技术的实施方案中，所述载体为表达载体，优选地，所述载体为pET28a载体。本专利技术的第四方面提供一种重组细胞，所述细胞包含本专利技术第二方面所述的基因或本专利技术第三方面所述的质粒。在本专利技术的实施方案中，所述重组细胞为大肠杆菌。在本专利技术的具体实施方案中，所述重组细胞为E.coliDH5α细胞。在本专利技术的另一个具体实施方案中，所述重组细胞为E.coliBL21细胞。本专利技术的第五方面提供一种检测GPC3的试剂盒，所述试剂盒包含本专利技术第一方面所述的纳米抗体。本专利技术的第六方面提供一种本专利技术第一方面所述纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对GPC3基因进行原核表达，收集表达的融合蛋白His-GPC3并纯化；(2)将纯化后的融合蛋白His-GPC3免疫骆驼；(3)提取步骤(2)骆驼脾脏组织的RNA，以其为模板反转成cDNA，特异性扩增骆驼重链抗体可变区基因；(4)将步骤(3)扩增到的基因经酶切后与pCANTAB5E质粒连接，转化至大肠杆菌TG1，获得VHH抗体库。(5)将辅助噬菌体M13KO7加入至上述VHH抗体库中，制备噬菌体展示文库，并对噬菌体展示文库进行滴度测定；(6)利用融合蛋白His-GPC3从噬菌体展示文库筛选出能够与GPC3特异性结合的纳米抗体，测序鉴定所述特异性结合的纳米抗体，获得该纳米抗体的基因。(7)构建表达载体，对其进行原核表达、纯化与鉴定。在本专利技术的实施方案中，在步骤(1)之前进一步包括扩增GPC3基因的步骤。在本专利技术的具体实施方案中，特异性扩增GPC3基因的引物序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。在本专利技术的具体实施方案中，步骤(2)中所述骆驼为新疆双峰驼。在本专利技术的具体实施方案中，步骤(3)中特异性扩增骆驼重链抗体可变区基因的上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。在本专利技术的具体实施方案中，步骤(4)中所述转化为电转化。本专利技术的第七方面提供本专利技术第一方面所述的纳米抗体或本专利技术第二方面所述的基因或本专利技术第三方面所述的质粒或本专利技术第四方面所述的细胞在制备治疗癌症的药物中的应用。在本专利技术的实施方案中，所述癌症为肝癌。附图说明图1示出了重组质粒pET28a-GPC3的菌液PCR和双酶切鉴定。A：M.DNAMarkerDL50001.重组质粒pET28a-GPC3菌液PCR鉴定；B：M.DNAMarkerDL50001.重组质粒pET28a-GPC3的双酶切产物。图2示出了融合蛋白His-GPC3的诱导表达蛋白及Western-blot鉴定。A：M.170.0KD1.BL21-pET28a诱导前2.BL21-pET28a诱导后3.BL21-His-GPC3诱导前4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白5BL21-His-GPC3诱导后上清6.BL21-His-GPC3诱导后沉淀；B：M.170.0KD1.His-GPC3诱导前2.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白3.BL21-His-GPC3诱导后上清4.BL21-His-GPC3诱导后沉淀图3示出了融合蛋白His-GPC3的不同温度的诱导表达。A：M.170.0KD1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀温度20℃5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀温度25℃；B：M.170.0KD1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀温度28℃5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀温度32℃。图4示出了融合蛋白His-GPC3的不同时间的诱导表达。A：M.170.0KD1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀时间3h5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀时间4h；B：M.170.0KD1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀时间6h5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀时间8h。图5示出了融合蛋白His-GPC3的不同诱导剂IPTG浓度的诱导表达。A：M.170.0KD1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀IPTG浓度0.3mmol/L5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀IPTG浓度0.5mmol/L；B：M.170.0KD1.BL21-His-GPC3诱导前2、3、4.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀IPTG浓度0.8mmol/L5、6、7.BL21-His-GPC3诱导后总蛋白、上清、沉淀IPTG浓度1.0mmol/L图6示出了新疆双峰驼抗GPC3血清滴度检测。图7示出了新疆双峰驼脾脏组织总RNA。图8示出了噬菌体展示文库的筛选。A：一轮本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗GPC3蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，优选地，所述纳米抗体仅由重链组成，优选地，所述纳米抗体的分子量大小为13kD。
【技术特征摘要】
1.一种抗GPC3蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，优选地，所述纳米抗体仅由重链组成，优选地，所述纳米抗体的分子量大小为13kD。2.编码如权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因包含SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。3.一种重组质粒，其特征在于，所述质粒包含权利要求2所述的基因。4.一种重组细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求2所述的基因或权利要求3所述的质粒。5.一种检测GPC3的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的抗体。6.权利要求1所述纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对GPC3基因进行原核表达，收集表达的融合蛋白His-GPC3并纯化；(2)将纯化后的融合蛋白His-GPC3免疫骆驼；(3)提取步骤(2)骆驼脾脏组织的RNA，以其为模板反转成cDNA，特异性扩增骆驼重链抗体可变区基因；(4)将步骤(3)扩增到的基因经酶切后与pCANTAB5E质粒...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏丽洁，腾桥，张富春，李金耀，
申请(专利权)人：新疆大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65
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