一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c的方法技术

一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c(Cyt c)的方法，属于纳米材料与生物检测技术领域，传统的和生物学的Cyt c还原和纯化方法是交换层析，它需要用还原剂(连二亚硫酸钠)将还原的Cyt c与几个洗脱步骤分离，而本发明专利技术所述方法非常简单。本发明专利技术还提供了一种基于过渡金属纳米材料还原Cyt c‑心磷脂脂质体混合物中Cyt c的方法，在本发明专利技术中与心磷脂脂质体结合的Cyt c过氧化物酶活性与氧化还原状态的关系首次借助镍纳米材料揭示；本发明专利技术还提供了一种基于过渡金属纳米材料检测线粒体中的细胞色素c的方法，通过简单易操作的实验过程来检测线粒体中的细胞色素c。

A method for the specific reduction of cytochrome c based on transition metal nanomaterials

A specific reduction method of cytochrome c (Cyt c) based on transition metal nanomaterials belongs to the field of nanomaterials and biological detection technology. The traditional and biological reduction and purification method of Cyt C is exchange chromatography. It needs to separate the reduced Cyt C from several elution steps by reducing agent (sodium dithionite). The method described in Ming is very simple. The present invention also provides a method for reducing Cyt C in a mixture of Cyt c_cardiolipin liposomes based on transition metal nanomaterials. The relationship between the activity of Cyt c peroxidase bound to the liposomes and the redox state is revealed for the first time by means of nickel nanomaterials; and the present invention also provides a transition-based method. The method of detecting cytochrome C in mitochondria by metal nano-materials is simple and easy to operate.

【技术实现步骤摘要】
一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c的方法
本专利技术属于纳米材料与生物检测
，具体涉及一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c(Cytc)的方法。
技术介绍
细胞色素是一类以铁卟啉或血红素作为辅基的电子传递蛋白，根据蛋白质中血红素辅基的不同，可分为不同的种类，例如细胞色素a、细胞色素b、细胞色素c等，细胞色素广泛参与细胞内的能量传递、新陈代谢和细胞凋亡等生命过程。体外研究细胞色素的结构和功能对于生物化学、药物代谢、毒理学、临床医学、肿瘤生化等领域具有重大的意义。而其中的细胞色素c(Cytc)为生物氧化过程中的电子传递体，其作用原理为在酶存在的情况下，对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。通常外源性细胞色素c(Cytc)不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素c便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用。在有关细胞凋亡的研究表明，细胞色素c与细胞凋亡有关，从线粒体中泄露出的细胞色素c有诱导细胞凋亡的作用。随着纳米技术的快速发展，金属纳米材料在医学成像、疾病诊断、药物传输、癌症治疗、基因治疗等领域的应用和基础研究也在飞速发展。由于过渡金属纳米材料的特性，它有着很高的催化性能，广泛应用于密封减震、医疗器械、声音调节、光显示等。而在这之中我们以镍和钴作为示例进行研究，镍(Ni)作为廉价的催化剂，具有多种关键特性，包括氧化添加和容易获得多种氧化态，以此来实现广泛的创新反应。另一方面，镍纳米材料已被用于表面增强拉曼散射(SERS)，它的增强能力取决于电磁机制引起的表面形态。在近年镍有着治疗癌症的巨大潜力，其作为诱导剂或细胞死亡的调节剂在癌症生物医学应用方面引起越来越多的关注。而且由于镍纳米材料具有固有的磁性，可以通过外部磁体靶向某些癌细胞，而不会对正常细胞造成不必要的损伤。研究细胞色素c氧化还原状态的转化及细胞色素c氧化还原状态如何调控细胞凋亡机制以及如何开发具有特定电子给体性质的Cytc人工纳米材料，并将其引入细胞，具有重要的意义。同时，Ni纳米材料对细胞色素氧化还原态的影响有助于更好地理解Ni纳米材料的形成机制。为此，在研究细胞功能中利用Ni和Co纳米材料的还原活性。作为氧化还原蛋白Cytc的新型还原性纳米材料，Ni和Co纳米材料显示出优于其他蛋白质还原方法的优点也是其创新点：(1)磁性使得能够通过外部磁体快速分离和收集Ni和Co纳米材料(在一分钟内)。因此，氧化的Cytc可以被快速还原并直接使用而无需复杂的纯化步骤；(2)镍和钴纳米材料的还原活性(对于Cytc是特异性的，这有助于研究复杂生物样品如Cytc-配体复合物或细胞蛋白提取物中Cytc的氧化还原状态的依赖性功能。
技术实现思路
针对上面的问题，我们首次将过渡金属镍(Ni)和钴(Co)纳米材料与几种细胞色素结合，发现细胞色素c与过渡金属纳米材料之间的特异性还原的性质，超越了现有的过渡金属纳米粒子和细胞的反应过程。本专利技术的第一目的是提供一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c的方法(实施例1)，传统的和生物学的Cytc还原和纯化方法是交换层析，它需要用还原剂(连二亚硫酸钠)将还原的Cytc与几个洗脱步骤分离，而此方法非常简单；本专利技术的第二目的是提供一种基于过渡金属纳米材料还原Cytc-心磷脂脂质体混合物中的Cytc的方法(实施例1)。在这里，与心磷脂脂质体结合的Cytc过氧化物酶活性与氧化还原状态的关系首次借助镍纳米材料揭示；本专利技术的第三目的是提供一种基于过渡金属纳米材料检测线粒体中的细胞色素c的方法(实施例2)，此方法设计了一种非常简单易操作的实验过程来检测线粒体中的细胞色素c。本专利技术所述的是一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c(Cytc)的方法，其步骤如下：①将六水合氯化镍或氯化钴以乙二醇作为溶剂，制成浓度为0.05～0.2mol/L的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液；②向1.0～1.2g氢氧化钠固体中加入30～40mL乙二醇，磁力搅拌30～60分钟，得到氢氧化钠的乙二醇溶液；③在步骤②得到的氢氧化钠的乙二醇溶液中加入10～20mL、质量分数为70％～80％的水合肼水溶液，搅拌至获得均匀的溶液；④将步骤③得到的溶液在磁场中加热至70～90℃后，将5～10mL步骤①得到的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液逐滴加入其中，继续搅拌10～20min，在溶液中得到黑色固体；⑤将步骤④得到的黑色固体产物用磁铁取出后，用去离子水和乙醇洗涤，然后在50～80℃下干燥10～20小时，得到Ni纳米材料或Co纳米材料；⑥称取细胞色素c，溶解于pH＝7.0～7.3的磷酸缓冲溶液中，制成100～200μmol/L细胞色素c的溶液，利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到该溶液的吸光度曲线；⑦称取0.0020～0.0030gNi纳米材料或Co纳米材料，与150～200μL步骤⑥制得的细胞色素c的溶液混合后，搅拌10～15分钟；⑧待细胞色素c溶液变色后，用磁铁将Ni纳米粒子或Co纳米粒子吸附在混合溶液底部，将上层溶液取出，然后利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到该溶液的吸光度曲线；通过对比步骤⑥和本步骤得到的吸光度曲线可以看到，曲线的特征峰位发生了红移，从而表明细胞色素c已被Ni纳米材料或Co纳米材料还原。进一步，①称取肌红蛋白或辣根过氧化物酶，分别溶解于pH＝7.0～7.3的磷酸缓冲溶液中，制成100～200μmol/L的溶液，利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到溶液的吸光度曲线；②称取0.0020～0.0030gNi纳米材料或Co纳米材料，分别与150～200μL步骤⑤制得的几种溶液混合，搅拌10～15分钟；③待溶液变色后，用磁铁将Ni纳米材料或Co纳米材料吸附在混合溶液底部，将上层溶液取出，然后利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，发现在紫外检测到的特征峰没有发生峰位的移动，证明镍和钴纳米材料没有将这两种细胞色素还原。上述操作，可以说明镍和钴纳米材料只能特异性还原细胞色素c。传统的和生物学的Cytc还原和纯化方法是交换层析，它需要用还原剂(连二亚硫酸钠)将还原的Cytc洗脱分离。在这里，作为氧化还原蛋白Cytc的新型还原性纳米材料，镍和钴纳米材料显示出优于其他蛋白质还原方法的优点：镍和钴纳米材料的还原活性对于Cytc是特异性的，这对于选择性还原复杂生物样品(例如像蛋白质提取物)中的Cytc是非常重要的。本专利技术所述的一种基于过渡金属纳米材料还原Cytc-心磷脂脂质体混合物中的Cytc的方法，其步骤如下(步骤①～⑤与前面所述的完全相同)：⑥配置成150～200μmol/L的Fe3+Cytc样品溶液，将0.002～0.003gNi纳米材料或Co纳米材料加入到150～200μL的Fe3+Cytc样品溶液中，然后利用磁铁将Ni纳米材料或Co纳米材料收集在样品溶液底部，Ni纳米材料或Co纳米材料将Fe3+Cytc还原成Fe2+Cytc；然后再将350～400μL、0.51～1.02mg/L的心磷脂脂质体溶液加入到上述样品溶液中，随后将心磷脂脂质体与Cytc溶液室温下一起温育20～30分钟，心磷脂脂质体与Fe2+Cytc结合，从而将样品溶液中的Fe2+Cytc氧化成Fe3+Cytc；⑦摇晃样品溶液让Ni纳米材料或Co纳米本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c的方法，其步骤如下：①将六水合氯化镍或氯化钴以乙二醇作为溶剂，制成浓度为0.05～0.2mol/L的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液；②向1.0～1.2g氢氧化钠固体中加入30～40mL乙二醇，磁力搅拌30～60分钟，得到氢氧化钠的乙二醇溶液；③在步骤②得到的氢氧化钠的乙二醇溶液中加入10～20mL、质量分数为70％～80％的水合肼水溶液，搅拌至获得均匀的溶液；④将步骤③得到的溶液在磁场中加热至70～90℃后，将5～10mL步骤①得到的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液逐滴加入其中，继续搅拌10～20min，在溶液中得到黑色固体；⑤将步骤④得到的黑色固体产物用磁铁取出后，用去离子水和乙醇洗涤，然后在50～80℃下干燥10～20小时，得到Ni纳米材料或Co纳米材料；⑥称取细胞色素c，溶解于pH＝7.0～7.3的磷酸缓冲溶液中，制成100～200μmol/L细胞色素c的溶液，利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到该溶液的吸光度曲线；⑦称取0.0020～0.0030g Ni纳米材料或Co纳米材料，与150～200μL步骤⑥制得的细胞色素c的溶液混合后，搅拌10～15分钟；⑧待细胞色素c溶液变色后，用磁铁将Ni纳米粒子或Co纳米粒子吸附在混合溶液底部，将上层溶液取出，然后利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到该溶液的吸光度曲线；通过对比步骤⑥和本步骤得到的吸光度曲线可以看到，曲线的特征峰位发生了红移，从而表明细胞色素c已被Ni纳米材料或Co纳米材料还原。...

【技术特征摘要】
1.一种基于过渡金属纳米材料特异性还原细胞色素c的方法，其步骤如下：①将六水合氯化镍或氯化钴以乙二醇作为溶剂，制成浓度为0.05～0.2mol/L的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液；②向1.0～1.2g氢氧化钠固体中加入30～40mL乙二醇，磁力搅拌30～60分钟，得到氢氧化钠的乙二醇溶液；③在步骤②得到的氢氧化钠的乙二醇溶液中加入10～20mL、质量分数为70％～80％的水合肼水溶液，搅拌至获得均匀的溶液；④将步骤③得到的溶液在磁场中加热至70～90℃后，将5～10mL步骤①得到的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液逐滴加入其中，继续搅拌10～20min，在溶液中得到黑色固体；⑤将步骤④得到的黑色固体产物用磁铁取出后，用去离子水和乙醇洗涤，然后在50～80℃下干燥10～20小时，得到Ni纳米材料或Co纳米材料；⑥称取细胞色素c，溶解于pH＝7.0～7.3的磷酸缓冲溶液中，制成100～200μmol/L细胞色素c的溶液，利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到该溶液的吸光度曲线；⑦称取0.0020～0.0030gNi纳米材料或Co纳米材料，与150～200μL步骤⑥制得的细胞色素c的溶液混合后，搅拌10～15分钟；⑧待细胞色素c溶液变色后，用磁铁将Ni纳米粒子或Co纳米粒子吸附在混合溶液底部，将上层溶液取出，然后利用紫外可见近红外分光光度计进行检测，得到该溶液的吸光度曲线；通过对比步骤⑥和本步骤得到的吸光度曲线可以看到，曲线的特征峰位发生了红移，从而表明细胞色素c已被Ni纳米材料或Co纳米材料还原。2.一种基于过渡金属纳米材料还原Cytc-心磷脂脂质体混合物中的Cytc的方法，其步骤如下：①将六水合氯化镍或氯化钴以乙二醇作为溶剂，制成浓度为0.05～0.2mol/L的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液；②向1.0～1.2g氢氧化钠固体中加入30～40mL乙二醇，磁力搅拌30～60分钟，得到氢氧化钠的乙二醇溶液；③在步骤②得到的氢氧化钠的乙二醇溶液中加入10～20mL、质量分数为70％～80％的水合肼水溶液，搅拌至获得均匀的溶液；④将步骤③得到的溶液在磁场中加热至70～90℃后，将5～10mL步骤①得到的氯化镍或氯化钴的乙二醇溶液逐滴加入其中，继续搅拌10～20min，在溶液中得到黑色固体；⑤将步骤④得到的黑色固体产物用磁铁取出后，用去离子水和乙醇洗涤，然后在50～80℃下干燥10～20小时，得到Ni纳米材料或Co纳米材料；⑥配置成150～200μmol/L的Fe3...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩晓霞，张海静，李俊博，赵冰，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22