一种用于血管紧张素转化酶活性检测的质谱探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于血管紧张素转化酶活性检测的质谱探针及其应用，属于药物筛选与评价技术领域。所述的质谱探针，包括氨基酸序列为Asp‑Ser‑Asp‑Lys‑Pro的多肽及修饰在所述多肽N端的天冬氨酸上的哌嗪类化合物。本发明专利技术提供的质谱探针由可被血管紧张素转化酶特异性识别的多肽Asp‑Ser‑Asp‑Lys‑Pro与高质谱响应的小分子哌嗪类化合物连接而成，不仅能被血管紧张素转化酶特异性识别并酶切，同时具有极高的质谱响应，质谱检测准确度高，能够准确反应血管紧张素转化酶的活性或血管紧张素转化酶抑制剂的抑制活性，也非常适用于从中药等复杂体系中筛选具有血管紧张素转化酶抑制活性的化合物。

A mass spectrometric probe for detection of angiotensinconverting enzyme activity and its application

The invention discloses a mass spectrometry probe for detecting the activity of angiotensin converting enzyme and its application, belonging to the technical field of drug screening and evaluation. The mass spectrometry probe comprises a polypeptide with an amino acid sequence of Asp_Ser_Asp_Lys_Pro and a piperazine compound modified on the N-terminal aspartic acid of the polypeptide. The mass spectrometry probe provided by the present invention is composed of a polypeptide Asp_Ser_Asp_Lys_Pro which can be specifically recognized by angiotensin converting enzyme and a small molecule piperazine compound with high mass spectrometry response. It can not only be specifically recognized by angiotensin converting enzyme and digested by enzyme, but also has high mass spectrometry response and high mass spectrometry detection accuracy. It can accurately reflect the activity of angiotensin converting enzyme or the inhibitory activity of angiotensin converting enzyme inhibitor, and is also very suitable for screening compounds with angiotensin converting enzyme inhibitory activity from complex systems such as traditional Chinese medicine.

【技术实现步骤摘要】
一种用于血管紧张素转化酶活性检测的质谱探针及其应用
本专利技术涉及药物筛选与评价
，具体涉及一种用于血管紧张素转化酶活性检测的质谱探针及其应用。
技术介绍
血管紧张素转化酶(Angiotensin-ConvertingEnzyme，ACE)是一种锌依赖型的膜结合外肽酶，广泛分布于哺乳动物的组织中。ACE可以通过肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensinsystem，RAS)和激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kininsystem，KKS)催化血管紧张素I转化为血管紧张素II，并使缓激肽失活，导致血压上升。此外，这两个系统对电解质和体液平衡、心血管系统发育和功能重塑也起着重要的调节作用。因此，ACE已成为治疗高血压、急性心肌梗死和心力衰竭等疾病的重要靶点。ACE抑制剂，如卡托普利、依那普利、贝拉普利等，已作为治疗高血压和心力衰竭的一线药物应用于临床。然而长期使用这些药物容易导致咳嗽、蛋白尿、肾功能衰退等副作用。近年来，从天然产物和传统中药中发现具有ACE抑制活性的新化合物已成为药物筛选领域的一个研究热点。ACE抑制剂的筛选依赖于相应的酶活性检测方法。目前，ACE活性的检测方法主要包括荧光光度法、分光光度法、高效液相色谱法、酶偶联法等。这些方法大都需要通过多个步骤进行样本处理、操作繁琐且存在灵敏度较低的问题。此外，这些方法的检测原理基本都是光学检测，容易受到本底的干扰。天然产物成分复杂，在底物的检测波段可能存在较强的吸收，因此这些方法较难直接应用于天然产物的筛选。公开号为CN1831529A的专利文献公开了一种用高效液相色谱和质谱联用快速筛选血管紧张素转化酶抑制剂的方法，以马尿酸双甘肽或马尿酸组氨酸亮氨酸为底物，纯化的兔肺血管紧张素转化酶或人空白血浆为血管紧张素转化酶的来源，在水浴中加热反应，过滤膜或离心之后，用高效液相色谱对血管紧张素转化酶反应混合溶液中底物、产物以及所加内标进行分离后，在电喷雾质谱的负离子模式下检测血管紧张素转化酶催化底物水解所生成的马尿酸。肽段化学衍生是蛋白质谱分析中常用一种样品预处理技术，通过在肽段的氨基、羧基或巯基上引入易电离的小分子标签，提高肽段的灵敏度和专属性并拓展质谱的检测范围。该技术为设计高质谱灵敏度的酶底物提供了一种新思路。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种的高质谱响应的质谱探针，作为酶底物，被血管紧张素转化酶特异性识别，通过质谱测定酶切反应前后的探针或酶切产物的量来检测血管紧张素转化酶的活性。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于血管紧张素转化酶活性检测的质谱探针，包括氨基酸序列为Asp-Ser-Asp-Lys-Pro的多肽及修饰在所述多肽N端的天冬氨酸上的哌嗪类化合物。本专利技术的质谱探针由可被血管紧张素转化酶特异性识别的多肽与高质谱响应的小分子连接而成。所述多肽的氨基酸序列为：天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸(SEQIDNO.1)，所述的高质谱响应的小分子为哌嗪类化合物，哌嗪类化合物的-NH与多肽链N端的天冬氨酸的羧基缩合。血管紧张素转化酶酶切位点为天冬氨酸-赖氨酸之间的酰胺键。因此，本专利技术质谱探针的酶切产物为哌嗪类化合物-天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸和赖氨酸-脯氨酸。由于哌嗪类化合物具有很强的质谱响应，因此通过测定反应前后该探针或酶切产物哌嗪类化合物-天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸的量，即可检测血管紧张素转化酶的活性。作为优选，所述哌嗪类化合物为1-(2-嘧啶基)哌嗪、1-(4-吡啶基)哌嗪或1-(1-甲基-4-吡啶基)哌嗪。更为优选，所述哌嗪类化合物为1-(2-嘧啶基)哌嗪。所述质谱探针的分子结构式如式(Ⅰ)所示，本专利技术还提供了一种合成所述的质谱探针的制备方法，包括：(1)以2-ChlorotritylChlorideResin树脂为载体，Fmoc保护的氨基酸为原料，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐为缩合剂，合成氨基酸序列为Asp-Ser-Asp-Lys-Pro的多肽；(2)按照步骤(1)的方法，在所述多肽N端的天冬氨酸上连接哌嗪类化合物，制得质谱探针粗品，经纯化制得所述的质谱探针。本专利技术采用固相合成法在多肽链N端的天冬氨酸上修饰哌嗪类化合物。N端的天冬氨酸离识别位点较远，在该位点上修饰哌嗪类化合物不会影响ACE识别。此外，用固相合成法容易对天冬氨酸侧链上的羧基进行修饰，探针的得率较高。具体地，所述制备方法，包括：一.树脂溶胀称取取代度为0.4mmol/g的2-ChlorotritylChlorideResin树脂，将树脂放入反应管中，加二氯甲烷(DCM)，振荡30min；二.接第一个氨基酸抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Pro-OH，再加入5倍摩尔量的二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振荡1h，用DMF和DCM交替清洗6遍；三.脱保护加入20％哌啶DMF溶液，反应5min，去掉溶剂，再次加入20％哌啶DMF溶液，反应15min，反应后用DMF、甲醇和DMF清洗两次；四.缩合3倍摩尔量的Fmoc-L-Lys(Boc)-OH和3倍摩尔量的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，用DMF溶解，加入反应管，立即加入5倍摩尔量DIEA，反应60min；反应后用DMF、甲醇和DMF清洗两次；重复以上步骤，从右到左依次连接上Asp、Ser、Asp和哌嗪类化合物，连接完成后用甲醇洗4次，抽干10min；五.切割配制切割液(TFA：水：EDT：TIS＝95：2.5：2：0.5)，从树脂上切割多肽，得到粗品探针。六.HPLC纯化多肽用HPLC纯化粗品探针，将纯化后的溶液冻干，-20℃保存待用。本专利技术的另一个目的是提供所述质谱探针的应用。所述质谱探针作为酶底物，可被血管紧张素转化酶特异性识别，酶切成哌嗪类化合物-天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸和赖氨酸-脯氨酸。通过质谱仪或液质联用仪测定酶切反应前后质谱探针或酶切产物哌嗪类化合物-天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸的量，利用差值表征血管紧张素转化酶的活性。因此，本专利技术提供了所述的质谱探针在制备检测血管紧张素转化酶活性的试剂盒中的应用。本专利技术还提供了所述的质谱探针在制备筛选血管紧张素转化酶抑制剂的试剂盒中的应用。本专利技术提供的质谱探针具有极高的质谱响应，极大提高了检测的灵敏度，另外，由于质谱探针和哌嗪类化合物-天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸的分子量是确定的，该检测方法的选择性和专属性很高，非常适用于从中药等复杂体系中筛选具有血管紧张素转化酶抑制活性的化合物。本专利技术还提供了所述的质谱探针在评价药物的血管紧张素转化酶抑制活性中的应用。利用本专利技术的质谱探针检测不同批次同种药物的血管紧张素转化酶抑制活性，进而评价不同批次药物的质量。本专利技术具备的有益效果：本专利技术提供的质谱探针由可被血管紧张素转化酶特异性识别的多肽Asp-Ser-Asp-Lys-Pro与高质谱响应的小分子哌嗪类化合物连接而成，不仅能被血管紧张素转化酶特异性识别并酶切，同时具有极高的质谱响应，质谱检测准确度高，能够准确反应血管紧张素转化酶的活性或血管紧张素转化酶抑制剂的抑制活性，也非常适用于从中药等复杂体系中筛选具有血管紧张素转化酶抑制活性的化合物。附图说明图1为ACE质谱探针纯度分析的HPLC色谱图。图2为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于血管紧张素转化酶活性检测的质谱探针，其特征在于，包括氨基酸序列为Asp‑Ser‑Asp‑Lys‑Pro的多肽及修饰在所述多肽N端的天冬氨酸上的哌嗪类化合物。

【技术特征摘要】
1.一种用于血管紧张素转化酶活性检测的质谱探针，其特征在于，包括氨基酸序列为Asp-Ser-Asp-Lys-Pro的多肽及修饰在所述多肽N端的天冬氨酸上的哌嗪类化合物。2.如权利要求1所述的质谱探针，其特征在于，所述哌嗪类化合物为1-(2-嘧啶基)哌嗪、1-(4-吡啶基)哌嗪或1-(1-甲基-4-吡啶基)哌嗪。3.如权利要求1所述的质谱探针，其特征在于，所述质谱探针的分子结构式如式(Ⅰ)所示，4.如权利要求1-3任一项所述的质谱探针的制备方法，其特征在于，包括：(1)以2-ChlorotritylChlorideResi...

【专利技术属性】
技术研发人员：程翼宇，李振皓，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33