一种基于DNA-银纳米簇构建电致化学发光传感器、制备及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于DNA‑银纳米簇构建电致化学发光传感器、制备及其应用，可以实现对miRNA‑21的灵敏性检测，通过加入目标物MiRNA，与目标物miRNA部分碱基互补配对的发夹DNA HP1被打开和目标物结合,形成目标物与发夹DNA H1的杂交链，在加入与发夹DNA HP1碱基互补配对更多的发夹DNA HP2以后，目标物miRNA逐渐被剥夺下来，参与下一次循环。因此miRNA的加入可引发这个催化发夹自组装放大系统，利用以DNA为模板形成的银纳米簇的电致化学发光信号检测目标物。

An electrochemiluminescence sensor based on DNA- silver nanocluster and its preparation and Application

The present invention provides an electrochemiluminescent sensor based on DNA_silver nanoclusters, its preparation and application, which can realize sensitive detection of microRNA_21. By adding target MiRNA, the hairpin DNA HP1 complementary to the target microNA partial base is opened and combined with the target to form the target and hairpin DNA H1. After adding more hairpin DNA HP2 complementary to the hairpin DNA HP1 base, the target microRNA was gradually deprived and participated in the next cycle. Therefore, the addition of microRNAs can trigger this catalytic hairpin self-assembly amplification system, which uses the electrochemiluminescence signal of silver nanoclusters formed by DNA template to detect the target.

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA-银纳米簇构建电致化学发光传感器、制备及其应用
本专利技术属于生物传感器
，具体涉及一种基于DNA-银纳米簇构建电致化学发光传感器、制备及其应用，可以实现对miRNA-21的灵敏性检测。
技术介绍
MicroRNAs(miRNAs)是一类小分子非编码核糖核酸(RNA)被发现在真核细胞中约有19－25核苷酸，它在真核生物中发挥关键作用。他们充当转录后基因表达调控者。越来越多的证据表明，miRNAs的异常表达与许多疾病有关，包括恶性肿瘤、癌症和神经退化。miRNAs的表达可作为癌症和其他疾病的诊断和治疗的生物标记。随着胚胎学和肿瘤学基础研究的迅速发展，miRNAs作为基因表遗传学的重要机制之一，受到越来越多的关注。对于miRNAs的检测，已经有很多传统的检测方法被用于检测miRNAs，其中包括Northern杂交、real-timePCR、基因芯片等。然而，这些方法具有一些固有的局限性。Northern杂交操作复杂且需要放射性标记，不仅会造成严重的污染，而且灵敏度低。real-timePCR和基因芯片技术虽然灵敏度高，但是所需要的仪器和试剂昂贵，因此限制了方法的广泛使用。尤其是基因芯片技术，几乎很少有使用者能负担得起。为了克服这些传统方法固有的缺点，一些低成本、高灵敏度的检测方法被发展起来是势在必行的。提供一个简单的、低检测限的和有选择性的方法来检测miRNAs十分必要。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于DNA-银纳米簇构建电致化学发光传感器及其制备方法，使用DNA双链为模板，利用硼氢化钠对硝酸银的还原作用合成银纳米簇，并且利用DNA与miRNA序列序列之间碱基的互补配对作用，构建了一个催化发夹自组装放大系统。通过加入目标物MiRNA，与目标物miRNA部分碱基互补配对的发夹DNAHP1被打开和目标物结合,形成目标物与发夹DNAH1的杂交链，在加入与发夹DNAHP1碱基互补配对更多的发夹DNAHP2以后，目标物miRNA逐渐被剥夺下来，参与下一次循环。因此miRNA的加入可引发这个催化发夹自组装放大系统，利用以DNA为模板形成的银纳米簇的电致化学发光信号检测目标物。本专利技术还提供了一种基于DNA-银纳米簇构建电致化学发光传感器检测miRNAs的应用。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供的一种基于DNA-银纳米簇构建电致化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)、将2.5OD的DNAS1、DNAHP1、DNAHP2和miRNA-21序列分别溶解在缓冲溶液中，得到DNAS1缓冲溶液、DNAHP1缓冲溶液、DNAHP2缓冲溶液和miRNA-21缓冲溶液；(2)、将抛光处理后的玻碳电极浸入氯金酸溶液中，进行电沉积，取出，清洗，得到修饰了金纳米粒子的玻碳电极；(3)、将步骤(2)得到的修饰了金纳米粒子的玻碳电极浸入到DNAS1的缓冲溶液中，培养，然后取出，清洗，得到修饰了单链DNAS1的玻碳电极；(4)、将步骤(3)得到的修饰了单链DNAS1的玻碳电极浸入6-巯基-1-己醇溶液中，培养，清洗；(5)、将miRNA-21缓冲溶液和DNAHP1、DNAHP2缓冲溶液混合，杂交，制备成DNAHP1-HP2溶液；(6)将步骤(4)中得到的修饰了6-巯基-1-己醇/DNAS1玻碳电极浸入步骤(5)中得到的DNAHP1-HP2溶液，培养，然后取出，清洗，得到修饰了DNAHP1-HP2的玻碳电极；(7)将步骤(6)得到的修饰了DNAHP1-HP2的玻碳电极浸入硝酸银溶液中，培养，再将电极浸入硼氢化钠溶液中，培养，然后取出，清洗，即得。具体的，步骤(1)为将购买的分别为2.5OD的DNAS1、DNAHP1和DNAHP2序列分别溶解在磷酸盐缓冲溶液中分别得到浓度为100μM的DNAS1缓冲溶液、浓度为100μMDNAHP1缓冲溶液和浓度为100μMDNAHP2缓冲溶液；2.5OD的miRNA-21用DEPC水配置成20μM的缓冲溶液，在4℃下保存备用；制得的上述溶液根据使用需要进行稀释。进一步的，步骤(1)中DNAS1序列为：5'-SH-GGTTGCTATATCG-3’；DNAHP1序列为：5'-CCCCCCCCCCCCTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCGTCTTGAGCTAGCTTATCAGACTGCGATATAGCAACC-3；DNAHP2序列为：5'-TAAGCTAGCTCAAGACGGTAGCTTATCAGACTGCCGTCTTGAGCCCCCCCCCCCCC；miRNA-21序列为：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。进一步的，步骤(1)中磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4,浓度为0.1M。具体的，步骤(2)为：将抛光处理后的玻碳电极浸入2mL质量分数为0.1％的氯金酸溶液中，进行电沉积，电沉积电位是-0.2V，电沉积时间是100秒。获得的金纳米粒子具有很好的生物兼容性，能结合多条设计好的探针，因此将制备的金纳米颗粒应用于生物传感器的检测具有很好的放大作用。进一步的，步骤(2)中，所述抛光处理后的玻碳电极具体处理方法为：玻碳电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO3:H2O＝1:1的溶液、乙醇溶液和超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3～5min。进一步的，步骤(3)具体为：将修饰了金纳米粒子的玻碳电极浸入5μM的DNAS1的缓冲溶液中培养10-12h后取出，用磷酸盐缓冲溶液清洗。以此清除没有吸附的探针DNAS1。进一步的，步骤(4)中所述培养，具体是：在37℃-40℃下培养1-1.5h。6-巯基-1-己醇用于封闭电极表面活性位点，避免非特异吸附。进一步的，步骤(5)具体是：将40μL5μM的DNAHP1缓冲溶液、40μL5μM的DNAHP2缓冲溶液和miRNA-21缓冲溶液混合，在37℃杂交2h得到DNAHP1-HP2溶液；进一步的，步骤(6)中所述培养，具体是：在37℃下培养1.5-2h。进一步的，步骤(7)具体是：将修饰了DNAHP1-HP2的玻碳电极浸入120μL30μM硝酸银溶液中，在4℃下避光培养0.5-1h，再浸入120μL30μM硼氢化钠溶液中，4℃下避光培养2-2.5h，利用硼氢化钠的还原性合成以DNA为模板的银纳米簇，然后取出，清洗，即得。本专利技术提供的一种基于DNA-银纳米簇构建电致化学发光传感器，采用上述方法制备得到。本专利技术提供的一种基于DNA-银纳米簇构建电致化学发光传感器检测miRNAs的应用，具体检测方法为：a、将2.5OD的DNAS1、DNAHP1、DNAHP2和miRNA-21序列分别溶解在缓冲溶液中，得到DNAS1缓冲溶液、DNAHP1缓冲溶液、DNAHP2缓冲溶液和miRNA-21缓冲溶液；b、将抛光处理后的玻碳电极浸入氯金酸溶液中，进行电沉积，取出，清洗，得到修饰了金纳米粒子的玻碳电极；c、将步骤b得到的修饰了金纳米粒子的玻碳电极浸入到DNAS1的缓冲溶液中，培养，然后取出，清洗，得到修饰了单链DNAS1的玻碳电极；d、将步骤c得到的修饰了单链DNAS1的玻碳电极浸入6-巯基-1-己醇溶液中，培养，清洗；e、将不同浓度的miRNA-21缓冲溶液和DNAHP1、DNAH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于DNA‑银纳米簇构建电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)、将2.5OD的DNAS1、DNA HP1、DNA HP2和miRNA‑21序列分别溶解在缓冲溶液中，得到DNA S1缓冲溶液、DNA HP1缓冲溶液、DNA HP2缓冲溶液和miRNA‑21缓冲溶液；(2)、将抛光处理后的玻碳电极浸入氯金酸溶液中，进行电沉积，取出，清洗，得到修饰了金纳米粒子的玻碳电极；(3)、将步骤(2)得到的修饰了金纳米粒子的玻碳电极浸入到DNAS1的缓冲溶液中，培养，然后取出，清洗，得到修饰了单链DNAS1的玻碳电极；(4)、将步骤(3)得到的修饰了单链DNAS1的玻碳电极浸入6‑巯基‑1‑己醇溶液中，培养，清洗；(5)、将miRNA‑21缓冲溶液和DNA HP1、DNA HP2缓冲溶液混合，杂交，制备成DNA HP1‑HP2溶液；(6)将步骤(4)中得到的修饰了6‑巯基‑1‑己醇/DNAS1玻碳电极浸入步骤(5)中得到的DNA HP1‑HP2溶液，培养，然后取出，清洗，得到修饰了DNA HP1‑HP2的玻碳电极；(7)将步骤(6)得到的修饰了DNA HP1‑HP2的玻碳电极浸入硝酸银溶液中，培养，再将电极浸入硼氢化钠溶液中，培养，然后取出，清洗，即得。...

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA-银纳米簇构建电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)、将2.5OD的DNAS1、DNAHP1、DNAHP2和miRNA-21序列分别溶解在缓冲溶液中，得到DNAS1缓冲溶液、DNAHP1缓冲溶液、DNAHP2缓冲溶液和miRNA-21缓冲溶液；(2)、将抛光处理后的玻碳电极浸入氯金酸溶液中，进行电沉积，取出，清洗，得到修饰了金纳米粒子的玻碳电极；(3)、将步骤(2)得到的修饰了金纳米粒子的玻碳电极浸入到DNAS1的缓冲溶液中，培养，然后取出，清洗，得到修饰了单链DNAS1的玻碳电极；(4)、将步骤(3)得到的修饰了单链DNAS1的玻碳电极浸入6-巯基-1-己醇溶液中，培养，清洗；(5)、将miRNA-21缓冲溶液和DNAHP1、DNAHP2缓冲溶液混合，杂交，制备成DNAHP1-HP2溶液；(6)将步骤(4)中得到的修饰了6-巯基-1-己醇/DNAS1玻碳电极浸入步骤(5)中得到的DNAHP1-HP2溶液，培养，然后取出，清洗，得到修饰了DNAHP1-HP2的玻碳电极；(7)将步骤(6)得到的修饰了DNAHP1-HP2的玻碳电极浸入硝酸银溶液中，培养，再将电极浸入硼氢化钠溶液中，培养，然后取出，清洗，即得。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中DNAS1序列为：5'-SH-GGTTGCTATATCG-3’；DNAHP1序列为：5'-CCCCCCCCCCCCTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCGTCTTGAGCTAGCTTATCAGACTGCGATATAGCAACC-3；DNAHP2序列为：5'-TAAGCTAGCTCAAGACGGTAGCTTATCAGACTGCCGTCTTGAGCCCCCCCCCCCCC；miRNA-21序列为：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体为：将修饰了金纳米粒子的玻碳电极浸入5μM的DNAS1的缓冲溶液中培养10-12h后取出，用磷酸盐缓冲溶液清洗。4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述培养，具体是在37℃-40℃下培养1-1.5h。5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广凤，冯秀云，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34