一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，采用拉曼光谱仪获取微藻细胞样本的拉曼光谱原始信息，然后将所得的拉曼光谱原始信息依次进行预处理、去除宇宙射线、基线校正和去噪平滑处理，最终得到待测微藻细胞的拉曼光谱曲线，将待测微藻细胞在1660cm‑1和1445cm‑1下的拉曼峰强的比值作为x代入IV=‑8.0436x2+116.59x+9.469中，计算得到微藻细胞中的脂肪酸不饱和度，上述微藻拉曼光谱在1445cm‑1处的拉曼峰强要扣除β‑胡萝卜素在1445cm‑1的拉曼峰强的影响。该测定方法操作简单，时间短，省时省力。

A method for determination of unsaturated fatty acids in microalgae cells

The invention discloses a method for determining the unsaturation of fatty acids in microalgae cells. Raman spectroscopy is used to obtain the original Raman spectrum information of microalgae cell samples, and then the original Raman spectrum information is sequentially preprocessed, cosmic rays are removed, baseline correction and denoising smoothing are processed, and finally the unmeasured Raman spectrum information is obtained. Raman spectroscopy curves of microalgae cells were used to calculate the unsaturation of fatty acids in IV = 8.0436x2+116.59x+9.46. The Raman spectra of microalgae cells at 1660cm_1 and 1445cm_1 were substituted as X to calculate the unsaturation of fatty acids in IV = 8.0436x2+116.59x+9.46. The influence of Raman intensity of CM 1 is also discussed. The method is simple, time saving, time saving and labor saving.

【技术实现步骤摘要】
一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法
本专利技术涉及一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，属于生物质能源检测领域。
技术介绍
微藻用于生产生物柴油已经有了一定的研究，但是在微藻积累油脂的原理及积累的动态过程等方面研究还相对较少。目前研究发现，脂肪酸的合成需要经过一系列的酶促反应，参与酶促反应的酶包括丙酮酸脱氢酶、乙酰-CoA羧化酶、脂肪酸合酶等，而经过这一系列的反应后脂肪酸需要进入叶绿体、内质网和细胞溶胶等细胞结构中进行长链脂肪酸的合成。各种藻类合成的脂肪酸成分与含量有较大的差异，脂肪酸在微藻干重中的比例也有显著差距，甚至在不同的培养条件下同种微藻内的脂肪酸成分和含量也会有产生影响。将微藻用于生产生物柴油时，细胞中的脂肪酸含量是重要的考虑因素之一。但是目前的检测手段对于微藻内油脂成分及含量的检测耗时长并且预处理复杂，不仅无法及时检测细胞内油脂含量并且无法对油脂积累的机理进行快速准确研究。拉曼成像技术是通过拉曼光谱技术与显微成像技术相结合的综合技术，能够对分子进行特异性“指纹”识别。拉曼成像技术能够获取整个细胞的光谱信息，通过特征峰位的分析可以确定特定物质在细胞内的分布。拉曼成像技术空间分辨率高，获取的光谱信息精准特异性强，可以获取细胞核亚细胞结构的可视化信息、分子的扩散和结构特性，蛋白质与蛋白质的相互作用及一些不可见的胞内反应。采用共聚焦显微拉曼技术观察茶叶感染炭疽病时细胞壁的结构和化学成分的变化，研究将共聚焦显微拉曼技术应用于植物病理学机制的研究中，取得了良好的实验结果。拉曼光谱技术在微藻中已有一定的研究，Moudfikova等人采用拉曼光谱技术通过获取整个蛋白核小球藻的光谱信息，通过特征峰位指认出多磷酸盐，并建立二维拉曼伪彩图表征出多磷酸盐在细胞中的分布。目前微藻细胞中的脂肪酸不饱和度检测方法采用气相色谱质谱法(GC-MS)方法，这种方法需要对样品进行前处理，因此该检测方法存在操作过程繁琐，耗时费力，需要消耗大量的有机试剂，难以实现大批量地快速定量检测等技术问题。参考文献【1】SamekO,ZemánekP,A,etal.Characterizationofoil-producingmicroalgaeusingRamanspectroscopy[J].LaserPhysicsLetters,2011,8(10):701-709.【2】ShaoY.N,FangH,ZhouH,etal.DetectionandimagingoflipidsofScenedesmusobliquusbasedonconfocalRamanmicrospectroscopy[J].BiotechnologyforBiofuels,2017,doi.org/10.1186/s13068-017-0977-8.【3】Sarwa,PrakashandKumarVerma,Sanjay.ToxicityassessmentofZn(II)solutiontreatedwithmicroalgaeScenedesmussp.MCC26usingSwissalbinomice.AnnualInternationalConferenceonAdvancesinBiotechnology(BioTech),2014(7):5-11.
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述的微藻细胞中的脂肪酸不饱和度检测方法所存在操作过程繁琐，耗时费力，需要消耗大量的有机试剂等技术问题而提供了一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，该测定方法不需要对样品进行前处理，操作简单，从而大大的节约了人力和时间的成本。本专利技术的技术方案一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，具体包括以下步骤：(1)、采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪测定β-胡萝卜素标准品的拉曼光谱曲线，计算β-胡萝卜素标准品在1445cm-1和1525cm-1的拉曼峰强度的比值；利用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪在对β-胡萝卜素标准品进行测定时，控制温度为25℃，将β-胡萝卜素标准品放置在拉曼光谱仪的载物台上，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50X的物镜聚焦到β-胡萝卜素标准品样本的表面，曝光时间1s，得到所述的拉曼光谱原始信息，然后将所得到的拉曼光谱原始信息依次进行预处理、去除宇宙射线、基线校正和去噪平滑处理，最终得到β-胡萝卜素标准品的拉曼光谱曲线；所述的预处理是采用去趋势算法De-trending对拉曼光谱原始信息进行处理；所述的去除宇宙射线是采用Renishaw的Wire软件对拉曼光谱原始信息进行处理；所述的基线校正是采用Unscrambler软件对拉曼光谱原始信息进行处理；所述的去噪平滑处理是采用卷积平滑方法对拉曼光谱原始信息进行处理；(2)、经琼脂固定的待测微藻细胞样品的制备将待测微藻接种到装有微藻培养基的250ml锥形瓶中，然后置于简易光生物培养机上，控制温度25℃、相对湿度为80％、光照强度2500Lux-3500Lux进行光照培养一周，光照培养过程中每24h中光照12h、黑暗12h，得到微藻液；所述的待测微藻为蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、衣藻或雨生红球藻；上述待测微藻光照培养过程中从开始光照培养直至光照培养结束，每隔一天取一次样测量微藻生物量，然后按照培养时间和微藻生物量的关系，判断微藻生命周期，取稳定期的微藻液作为待测微藻液；微藻生物量测定采用分光光度计法或血小板计数法；取上述的待测微藻液8ml于15ml离心管中，然后加入2ml蒸馏水稀释藻液，得到稀释后的待测微藻液；为了采集到活体微藻细胞拉曼光谱信号，用质量百分比浓度为2-4％的琼脂水溶液固定稀释后的待测微藻液中的待测微藻细胞，得到经琼脂固定的待测微藻细胞样品，步骤如下：将琼脂粉加入到蒸馏水中，升温到40℃，得到质量百分比浓度为2-4％的琼脂水溶液，然后按体积比计算，稀释后的待测微藻液：质量百分比浓度为2-4％的琼脂水溶液均为1:5的比例，将稀释后的待测微藻液与上述质量百分比浓度为2-4％的琼脂水溶液进行混合均匀，待琼脂冷却凝固后，即得到经琼脂固定的待测微藻细胞样品；(3)、通过双层刀片切取步骤(2)所得的经琼脂固定的待测微藻细胞样品，放置于载玻片上，盖上盖玻片，然后放置在雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪的载物台上，控制温度为25℃，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50X的物镜聚焦到经琼脂固定的待测微藻细胞样品的表面，曝光时间1s，在雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪下进行观察经琼脂固定的待测微藻细胞样品，得到待测微藻细胞样品拉曼光谱原始信息，然后将所得到的待测微藻细胞样品的拉曼光谱原始信息依次进行预处理、去除宇宙射线、基线校正和去噪平滑处理，最终得到待测微藻细胞的拉曼光谱曲线，进一步得到待测微藻细胞在1525cm-1处的拉曼峰强为F1，在1445cm-1的拉曼峰强为F2，在1660cm-1的拉曼峰强为F5；由于原始拉曼光谱图受荧光干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号，因此要先进行预处理，所述的预处理是采用去趋势算法De-trending对拉曼光谱原始信息进行处理；所述的去除宇宙射线是采用Renishaw的Wire3.3软件对拉曼光谱原始信息进行处理；由于采集微藻样品拉曼光谱时，获取的生物体拉曼光谱会存在一定的荧光背景本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，其特征在于具体包括以下步骤：(1)、采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪测定β‑胡萝卜素标准品的拉曼光谱曲线，计算β‑胡萝卜素标准品在1445cm‑1和1525cm‑1的拉曼峰强的比值为A；(2)、经琼脂固定的待测微藻细胞样品的制备①、将待测微藻接种到装有微藻培养基的250ml锥形瓶中，然后置于简易光生物培养机上，控制温度25℃、相对湿度为80％、光照强度2500Lux‑3500Lux进行光照培养一周，光照培养过程中每24h中光照12h、黑暗12h，得到微藻液；所述的待测微藻为蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、衣藻或雨生红球藻；取稳定期的微藻液作为待测微藻液；取上述的待测微藻液8ml于15ml离心管中，然后加入2ml蒸馏水稀释藻液，得到稀释后的待测微藻液；②、用质量百分比浓度为2‑4％的琼脂水溶液固定步骤①所得的稀释后的待测微藻液中的待测微藻细胞，得到经琼脂固定的待测微藻细胞样品；(3)、通过双层刀片切取步骤(2)所得的经琼脂固定的待测微藻细胞样品，放置于载玻片上，盖上盖玻片，然后放置在雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪的载物台上，控制温度为25℃，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50X的物镜聚焦到经琼脂固定的待测微藻细胞样品的表面，曝光时间1s，在雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪下进行观察将琼脂固定的待测微藻细胞样品，得到待测微藻细胞样品拉曼光谱原始信息，然后将所得到的待测微藻细胞样品拉曼光谱原始信息依次进行预处理、去除宇宙射线、基线校正和去噪平滑处理，最终得到待测微藻细胞的拉曼光谱曲线，进一步得到待测微藻细胞在1525cm‑1处的拉曼峰强为F1，在1445cm‑1的拉曼峰强为F2，在1660cm‑1的拉曼峰强为F5；所述的预处理是采用去趋势算法De‑trending对拉曼光谱原始信息进行处理；所述的去除宇宙射线是采用Renishaw的Wire3.3软件对拉曼光谱原始信息进行处理；所述的基线校正是采用Unscrambler软件对拉曼光谱原始信息进行处理；所述的去噪平滑处理是采用卷积平滑方法对拉曼光谱原始信息进行处理；(4)、利用β‑胡萝卜素标准品在1445cm‑1和1525cm‑1的拉曼峰强的比值A和待测微藻细胞拉曼光谱曲线在1525cm‑1处的拉曼峰强F1，计算出待测微藻细胞在1445cm‑1处其含有β‑胡萝卜素的拉曼峰强F3，即F3＝A*F1；(5)、将待测微藻细胞在1445cm‑1的拉曼峰强F2扣除其在1445cm‑1处其含有β‑胡萝卜素的拉曼峰强F3，即得到待测微藻细胞不含β‑胡萝卜素，仅为有效的脂肪酸在1445cm‑1的拉曼峰强F4，即F4＝F2‑F3；(6)、通过脂肪酸标准品不饱和度和1660cm‑1和1445cm‑1下的拉曼峰强的比值的关系，得到脂肪酸标准品不饱和度的计算公式：IV＝‑8.0436x2+116.59x+9.469，其中IV为脂肪酸标准品的不饱和度，x为脂肪酸标准品在1660cm‑1和1445cm‑1下的拉曼峰强的比值；(7)、将待测微藻细胞在1660cm‑1和1445cm‑1下的拉曼峰强的比值F5/F4作为x代入步骤(6)所得的公式IV＝‑8.0436x2+116.59x+9.469中，即得待测微藻细胞中的脂肪酸不饱和度值IV。...

【技术特征摘要】
1.一种微藻细胞中的脂肪酸不饱和度的测定方法，其特征在于具体包括以下步骤：(1)、采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪测定β-胡萝卜素标准品的拉曼光谱曲线，计算β-胡萝卜素标准品在1445cm-1和1525cm-1的拉曼峰强的比值为A；(2)、经琼脂固定的待测微藻细胞样品的制备①、将待测微藻接种到装有微藻培养基的250ml锥形瓶中，然后置于简易光生物培养机上，控制温度25℃、相对湿度为80％、光照强度2500Lux-3500Lux进行光照培养一周，光照培养过程中每24h中光照12h、黑暗12h，得到微藻液；所述的待测微藻为蛋白核小球藻、微绿球藻、普通小球藻、衣藻或雨生红球藻；取稳定期的微藻液作为待测微藻液；取上述的待测微藻液8ml于15ml离心管中，然后加入2ml蒸馏水稀释藻液，得到稀释后的待测微藻液；②、用质量百分比浓度为2-4％的琼脂水溶液固定步骤①所得的稀释后的待测微藻液中的待测微藻细胞，得到经琼脂固定的待测微藻细胞样品；(3)、通过双层刀片切取步骤(2)所得的经琼脂固定的待测微藻细胞样品，放置于载玻片上，盖上盖玻片，然后放置在雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪的载物台上，控制温度为25℃，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50X的物镜聚焦到经琼脂固定的待测微藻细胞样品的表面，曝光时间1s，在雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪下进行观察将琼脂固定的待测微藻细胞样品，得到待测微藻细胞样品拉曼光谱原始信息，然后将所得到的待测微藻细胞样品拉曼光谱原始信息依次进行预处理、去除宇宙射线、基线校正和去噪平滑处理，最终得到待测微藻细胞的拉曼光谱曲线，进一步得到待测微藻细胞在1525cm-1处的拉曼峰强为F1，在1445cm-1的拉曼峰强为F2，在1660cm-1的拉曼峰强为F5；所述的预处理是采用去趋势算法De-trending对拉曼光谱原始信息进行处理；所述的去除宇宙射线是采用Renishaw的Wire3.3软件对拉曼光谱原始信息进行处理；所述的基线校正是采用Unscrambler软件对拉曼光谱原始信息进行处理；所述的去噪平滑处理是采用卷积平滑方法对拉曼光谱原始信息进行处理；(4)、利用β-胡萝卜素标准品在1445cm-1和1525cm-1的拉曼峰强的比值A和待测微藻细胞拉曼光谱曲线在1525cm-1处的拉曼峰强F1，计算出待测微藻细胞在1445cm-1处其含有β-胡萝卜素的拉曼峰强F3，即F3＝A*F1；(5)、将待测微藻细胞在1445cm-1的拉曼峰强F2扣除其在1445cm-1处其含有β-胡萝卜素...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵咏妮，朱亦鸣，庄松林，顾伟民，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31