一种复合纳米钻石药物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种复合纳米钻石药物及其制备方法和应用。所述药物是以纳米钻石(Nanodiamond，ND)为载体，在柠檬酸钠存在下，先后将米托蒽醌(Mitoxantrone，MTO)和阿霉素(Doxorubicin，DOX)以物理吸附的方式负载于ND表面得到复合纳米药物(ND/MTO/DOX)。通过JC‑1法检测细胞线粒体膜电位的变化情况，发现该复合纳米药物造成线粒体膜电位下降的程度最大；通过MTT法证实，MTO与DOX的协同效应，在很大程度上提高了对癌细胞的杀伤力，且该复合纳米药物具有缓释药物特性；共聚焦结果表明ND/MTO/DOX复合纳米药物主要定位于溶酶体中，且随时间延长，药物未迁移到细胞核，我们推测该体系可能造成溶酶体通透性增加，使大量水解酶释放，从而促进细胞凋亡。该复合纳米钻石药物可在制备抗肿瘤药物中应用。

Compound nano diamond medicine, preparation method and application thereof

The invention provides a compound nano diamond medicine, a preparation method and application thereof. In the presence of sodium citrate, nanodiamond (ND) was used as the carrier to physically adsorb mitoxantrone (MTO) and doxorubicin (DOX) onto the surface of ND to form a composite nanodrug (ND / MTO / DOX). The change of mitochondrial membrane potential was detected by JC_1 method, and it was found that the mitochondrial membrane potential was lowered to the greatest extent by the composite nanodrug. The results showed that ND / MTO / DOX nanoparticles were mainly localized in the lysosome, and the drug did not migrate to the nucleus as time went on. We speculated that the system might increase the permeability of lysosome, release a large number of hydrolases, and promote cell apoptosis. The compound nanodiamond drug can be used in the preparation of antineoplastic agents.

【技术实现步骤摘要】
一种复合纳米钻石药物及其制备方法和应用
本专利技术涉及纳米药物，特别涉及一种同时负载两种抗癌药物的纳米钻石多重药物，具体是一种纳米钻石/米托蒽醌/阿霉素复合纳米钻石药物及其制备方法和应用。
技术介绍
当今社会食品安全和环境污染问题日益严峻，癌症发病率逐年上升，已成为最主要的人类“杀手”之一。目前癌症治疗手段主要有：手术、放射与化学药物治疗三种常规方法。其中因化学疗法操作简单，被广泛用于临床，例如阿霉素、甲氨蝶呤与米托蒽醌等。在某种程度上，化学疗法是有效的，但其在正常组织的非特异性生物分布和对健康快速分裂细胞的影响，导致病人产生严重的毒副作用。此外，化疗药物存在溶解度差、在体内降解快速且血液循环时间短等诸多缺陷，故急需设计高效且低毒的药物靶向输送系统治疗癌症。随着人们对肿瘤微环境的认识和近年来纳米技术的迅速发展，纳米材料已然成为科学家们的“研究宠儿”。在众多纳米材料中，由于纳米钻石(ND)生物相容性好、表面易修饰且比表面积大等诸多优点，已被广泛地用于靶向递送药物和基因。以蒽环类为主的化疗药物，如阿霉素，表柔比星，柔红霉素，可以通过静电吸附、π-π相互作用、范德华力和氢键等方式物理吸附于ND表面。纵然纳米钻石载药体系在很多方面尤于游离的药，但肿瘤仍难消除，易复发，这归因于该纳米材料体系仅仅携带一种化疗药物。因此，亟需制备可以同时携带多种抗癌药物分子且可以协同治疗肿瘤的纳米钻石新体系。米托蒽醌(Mitoxantrone，MTO)是一种人工合成蒽环类抗肿瘤药物，是一种临床上广泛应用的抗癌药，在乳腺癌、急性白血病和淋巴瘤中表现出较高的疗效，可通过物理吸附负载到ND上。基于阿霉素和米托蒽醌的结构相似，本文以羧酸化的纳米钻石，在柠檬酸钠作用下物理吸附化疗药物米托蒽醌与阿霉素制备得到多重纳米药物，并研究了该种药物的抗肿瘤活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种同时负载两种化疗药物的纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在抗肿瘤中的应用。本专利技术提供的一种同时负载两种化疗药物(米托蒽醌与阿霉素)的纳米钻石药物的制备方法，包括如下步骤：按照质量比7-10：1.5-3：1称取ND、MTO与DOX，先将ND超声分散于柠檬酸钠溶液中，30min后，加入MTO，室温搅拌0.5-1.5h，离心，用蒸馏水洗涤直至上清液为无色，收集上清液，记录液体体积，得到ND/MTO纳米药物；再将ND/MTO纳米药物超声分散于柠檬酸钠溶液中，30min后，加入DOX，室温搅拌0.5-1.5h后，离心，用蒸馏水洗涤直至上清液为无色，收集上清液，记录液体体积，所得ND/MTO/DOX复合纳米药物置于真空冷冻干燥机干燥，备用。ND、MTO、DOX质量比优选为8.3：2：1。柠檬酸钠溶液的浓度为1.0M。室温搅拌时间优选1h。上述制备的复合纳米钻石药物可以在协同抗肿瘤中应用。与现有技术相比本专利技术的有益效果：本专利技术选用的纳米钻石材料具有生物相容性好、表面易修饰且比表面积大等诸多优点；米托蒽醌和阿霉素是两种广泛应用于临床的抗肿瘤药物，在治疗乳腺癌和淋巴瘤中表现出较高的疗效，且各自可通过物理吸附负载于ND上；鉴于阿霉素和米托蒽醌的结构相似，在柠檬酸钠作用下，便于一起通过物理吸附的方式负载于ND表面，且制备方法简单、省时。所制备的复合纳米钻石药物抗癌效果优于单一纳米钻石药物。前期研究表明，纳米钻石载药体系被细胞摄取后，药物解离进入细胞核从而诱导细胞凋亡，而本申请所制备的ND/MTO/DOX复合纳米药物新体系则可能是通过改变溶酶体通透性的方式，使得大量的溶酶体水解酶释放，最终达到抑制肿瘤生长的目的。通过JC-1法检测复合纳米药物对人肝癌细胞(HepG2)内线粒体膜电位变化情况，发现纳米钻石对其几乎无影响，而与游离药物对比，复合纳米药物造成线粒体的膜电位下降幅度最大，暗示着纳米钻石是优秀的载体，毒性小，且合成的复合纳米药物对癌症的治疗有较好的疗效；通过激光共聚焦结果表明ND/MTO/DOX复合纳米药物主要存在于细胞质中，且定位于溶酶体中；经MTT法检测复合纳米药物对HepG2细胞的活性，表明ND/MTO/DOX复合纳米药物具有抗癌选择性，同时利用MTO与DOX的协同效应，使复合纳米药物体系疗效优于单一纳米药物，在很大程度上提高了对癌细胞的杀伤力，且具有缓释药物特性，所以ND/MTO/DOX复合纳米钻石药物可在制备抗肿瘤药物中应用。附图说明图1各种纳米颗粒的红外光谱图图2各种纳米颗粒的扫描电镜图图3JC-1染色法检测ND/MTO/DOX复合纳米药物对线粒体膜电位影响图4ND/MTO/DOX复合纳米药物抗癌选择性图5不同种类的药物对体外培养HepG2细胞活性的影响(24h)图6不同种类的药物对体外培养HepG2细胞活性的影响(48h)图7纳米钻石对体外培养HepG2细胞活性的影响(48h)图8ND/MTO/DOX复合纳米药物细胞内成像图图9ND/MTO/DOX复合纳米药物细胞内定位图具体实施方式以下为实施例中使用的材料：纳米钻石(ND，元素六，直径大约140nm,Ireland)。阿霉素(DOX)是盐酸多柔比星，分子式为C27H29NO11·HCl，分子量为579.99，山西普德药业有限公司，规格按C27H29NO11·HCl计算为10mg。米托蒽醌(MTO)分子式为C22H30Cl2N4O6,分子量为517.4，上海生物科技有限公司，规格按C22H30Cl2N4O6·HCl计算为1g。二水合柠檬酸钠(C6H5Na3O7·2H2O，分子量为294.10)为天津市登峰化学试剂厂。实施例1一种纳米钻石/米托蒽醌/阿霉素(ND/MTO/DOX)复合纳米钻石药物的制备方法，包括如下步骤：称取1mgND,将其超声分散于柠檬酸钠(Na3Cit，1.0M，1mL)溶液中，30min后，加入240μgMTO，室温搅拌1h，离心，用蒸馏水洗涤直至上清液为无色，收集上清液，记录液体体积，得到ND/MTO纳米药物。随后将ND/MTO纳米药物超声分散于柠檬酸钠溶液中，30min后，加入120μgDOX，室温搅拌1h后，离心，用蒸馏水洗涤直至上清液为无色，收集上清液，记录液体体积，所得纳米钻石/米托蒽醌/阿霉素(ND/MTO/DOX)复合纳米钻石药物置于真空冷冻干燥机干燥，备用。通过测定DOX在480nm处吸光度(DOXε480nm＝11500cm-1·mol-1·L-1)，MTO在609nm处的吸光度，根据各自的标准曲线，算出上清液各自的含量，从而得出MTO与DOX在ND上各自的吸附量分别为119.2±3.0μg/mg和60.1±3.0μg/mg。实施例2红外光谱图表征通过红外光谱仪，我们可以对ND/MTO/DOX复合纳米药物的表面化学性质进行表征，确定MTO与DOX是否吸附于ND表面，且ND/MTO/DOX复合纳米药物中是否含有Na3Cit。取少量干燥好的纳米颗粒与KBr混合压片，采用红外光谱仪测定各自的红外光谱图，并分析谱图。图1为各种材料的红外光谱图。如图1(A)所示，在ND的红外光谱图中，可以看出其表面富含羧基，表明ND成功被强酸氧化处理；在ND/MTO/DOX复合纳米药物红外光谱图中，图框标记的特征吸收峰与图1(B)中Na3Cit红外谱图(图框标记)的特征吸收峰一致，说明在ND本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米钻石/米托蒽醌/阿霉素(ND/MTO/DOX)复合纳米钻石药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：按照质量比7‑10：1.5‑3：1称取ND、MTO与DOX,先将ND超声分散于柠檬酸钠溶液中，30min后，加入MTO，室温搅拌0.5‑1.5h，离心，用蒸馏水洗涤直至上清液为无色，收集上清液，记录液体体积，得到ND/MTO纳米药物；再将ND/MTO纳米药物超声分散于柠檬酸钠溶液中，30min后，加入DOX，室温搅拌0.5‑1.5h后，离心，用蒸馏水洗涤直至上清液为无色，收集上清液，记录液体体积，所得ND/MTO/DOX复合纳米钻石药物置于真空冷冻干燥机干燥，备用。

【技术特征摘要】
2018.04.17 CN 20181034186671.一种纳米钻石/米托蒽醌/阿霉素(ND/MTO/DOX)复合纳米钻石药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：按照质量比7-10：1.5-3：1称取ND、MTO与DOX,先将ND超声分散于柠檬酸钠溶液中，30min后，加入MTO，室温搅拌0.5-1.5h，离心，用蒸馏水洗涤直至上清液为无色，收集上清液，记录液体体积，得到ND/MTO纳米药物；再将ND/MTO纳米药物超声分散于柠檬酸钠溶液中，30min后，加入DOX，室温搅拌0.5-1.5h后，离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：李英奇，杜祥斌，赵文静，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14