一种培育不飞行瓢虫的方法技术

本发明专利技术公开了一种培育不飞行瓢虫的方法，采用基因干扰的方法，干扰瓢虫翅发育关键基因vestigial或ultrabithorax的表达，培育不飞行瓢虫，具体包括注射dsRNA、饲喂dsRNA/纳米载体或将dsRNA/纳米载体/表面活性助剂浸泡、喷雾或滴加到瓢虫体表三种方法。本发明专利技术通过三种潜在的基因干扰的方法，培育不飞行瓢虫，该方法高效稳定，能够彻底解决人工释放天敌瓢虫在防治区域内难以定殖的难题，具有重要的理论和实际意义；通过将饲喂法和体壁渗透法应用到基因干扰中，彻底改变了传统方法耗时耗力的现状，大幅度提升其效率和成功率，降低成本和操作难度；该方法社会效益和经济价值明显，无潜在生态风险。

A method of cultivating no flying ladybug

The invention discloses a method for cultivating non flying ladybirds, which interferes with the expression of the key gene vestigial or Ultrabithorax of the Ladybird's wing development by means of gene interference, and does not cultivate flying ladybirds, including injection of dsRNA, feeding of dsRNA/ nano carriers, or immersion, spray or dripping of dsRNA/ nano carriers / surface active agents. There are three ways to ladybug. The method is highly effective and stable, and can thoroughly solve the difficult problem of artificial release of natural enemy Ladybirds in the control area, and has important theoretical and practical significance; through the application of feeding method and body wall penetration method to gene interference, the method is thoroughly improved. It has changed the time-consuming and energy-consuming status of traditional methods, greatly improved their efficiency and success, reduced costs and operational difficulties, and has obvious social and economic benefits and no potential ecological risks.

【技术实现步骤摘要】
一种培育不飞行瓢虫的方法
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种培育不飞行瓢虫的方法。
技术介绍
瓢虫种类繁多，在昆虫分类系统中隶属于鞘翅目多食亚目扁甲总科。目前，已知的瓢虫有500属5000种左右，其中，捕食性瓢虫约占瓢虫种类的80％，以捕食介壳虫、蚜虫、粉虱、叶螨以及其它节肢动物为主，多为农林害虫的重要天敌，其中，异色瓢虫(Harmoniaaxyridis)是受到广泛关注的捕食性瓢虫之一，与其他捕食性瓢虫相比，其具有易饲养、捕食能力强、取食量大等特点，较强的环境适应性使得异色瓢虫成为捕食蚜虫的优势性天敌。虽然瓢虫在防治蚜虫等有害生物方面有着诸多优势，但是在田间释放的实际操作过程中往往面临着许多问题，如释放时期、释放次数和释放量等，但是其中最重要的是如何保证人工释放的瓢虫品种在防治区域内不飞走和成功定殖。瓢虫成虫一般具有较强的飞行能力，能够远距离迁移，通过筛选飞行能力弱的品种可以从根源上解决这一问题。目前，法国学者已经从异色瓢虫的自然种群中筛选出了飞行能力低下的瓢虫和不能飞行的雌雄成虫，用于温室等封闭环境的害虫防治工作，但是通过传代筛选的方式往往需要十几代才能获得稳定品系，且存活力和繁殖力都会出现大幅度的下降，在自然环境中容易被野生型同化，不适合大田释放。随着遗传操作和表观调控等技术的发展，在幼虫阶段，通过调节瓢虫翅发育的关键基因，以获得无飞行能力的翅缺陷成虫已经成为可能。RNA干扰(RNAinterference，RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA分子)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，这些特殊设计的外源dsRNA分子，能够特异、高效且持久地降低特定基因的表达，对于研究未知基因功能、调控昆虫的发育和行为和保护植物免受病毒侵害具有重要意义。RNA干扰已作为一种重要手段，被广泛应用于各类基因功能鉴定、功能基因表达调控领域，同时，由于dsRNA分子高度的特异性、释放后易降解等特性，使其成为一种专门靶向害虫的、对非靶标生物安全的遗传学控制策略。近年来，纳米科技迅猛发展，在农业领域应用迅速发展，其中之一就是利用纳米载体的靶向传输与控释功能，递送核酸药物(DNA或RNA)至昆虫体内，打破昆虫体内的器官基底膜和细胞膜屏障和肠道围食膜屏障，促进细胞吸收外源核酸分子，提高外源核酸分子的作用效率。目前有潜在的注射法，饲喂法，以及体壁渗透法三种办法实现基因干扰(RNAi)；其中，借助纳米载体递送dsRNA分子能够大幅度提升对昆虫基因的干扰效率。利用RNA干扰技术与纳米载体相结合的方法，培育出不飞行瓢虫，可以解决人工释放的天敌昆虫在防治区域内的定殖难题、推动天敌昆虫在农业防治工作中应用。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种培育不飞行瓢虫的方法。本专利技术采用如下技术方案：一种培育不飞行瓢虫的方法，采用基因干扰的方法，干扰瓢虫翅发育关键基因vestigial或ultrabithorax的表达，培育不飞行瓢虫。在上述技术方案中，所述基因干扰的方法为注射dsRNA，具体包括以下步骤：S1、利用dsRNA合成试剂盒合成瓢虫vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA；S2、对瓢虫幼虫注射vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA。优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA的注射量分别为10-100ng；所述瓢虫幼虫为4龄第1天的幼虫。具体地，所述瓢虫为异色瓢虫时，所述注射位置为腹部第三节与第四节节间膜处。在上述技术方案中，所述基因干扰的方法为饲喂dsRNA/纳米载体，具体包括以下步骤：S1、利用dsRNA合成试剂盒合成瓢虫vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA；S2、将vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体溶液混合得到dsRNA/纳米载体，随后将dsRNA/纳米载体与人工饲料混匀得到瓢虫饲料；S3、采用瓢虫饲料饲喂瓢虫幼虫。在混合过程中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体通过静电作用、氢键和范德华力的作用结合成为稳定的dsRNA/纳米载体分子复合体；在纳米载体的作用下，dsRNA分子穿透昆虫肠道围食膜和肠细胞膜的能力大大提升，干扰效率也随之提高。在本专利技术中，所述人工饲料可由市售的猪肝、酵母、蔗糖和蜂蜜按质量比10：3：4：4的比例混合配制而成。优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体溶液的电荷比为1:8-8:1，优选为1:1。优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述dsRNA/纳米载体与所述人工饲料的体积比为1:5-1:20，优选为1:10。优选地，在上述技术方案中，步骤S3中，所述饲喂阶段为瓢虫的整个幼虫阶段。在上述技术方案中，所述基因干扰的方法为将dsRNA/纳米载体/表面活性助剂浸泡、喷雾或滴加到瓢虫体表，具体包括以下步骤：S1、利用dsRNA合成试剂盒合成瓢虫vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA；S2、将vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA，与纳米载体溶液和表面活性助剂混合，得到复合体药液；S3、将复合体药液浸泡、喷雾或滴加到瓢虫体表。在混合过程中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体通过静电作用、氢键和范德华力的作用结合成为稳定的dsRNA/纳米载体分子复合体；同时，借助表面活性助剂发挥的浸润和除脂作用，溶化瓢虫体表的蜡质层，降低表皮抗御性，使所得到的复合体药液液滴易于吸附至瓢虫体表并穿透瓢虫体壁进入体腔、组织和细胞内，从而高效干扰靶标基因的表达。优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体溶液的电荷比为1:8-8:1，优选为1:1。优选地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述表面活性助剂在所述复合体药液中所占的体积比例为4.5-18％，优选为10％。在本专利技术中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA为能够特异性降解同源mRNA(信使RNA)的双链RNA分子，不限于其片段大小和二级结构种类。在上述技术方案中，所述纳米载体为内部具有空腔结构，且表面携带正电荷的纳米载体。优选地，在上述技术方案中，所述纳米载体为具有高密度亲水性官能团的纳米载体。在本专利技术中，所述纳米载体的内部空腔结构和高密度官能团结构有利于vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA分子的装载，形成稳定复合体，同时保护dsRNA分子生物大分子免受生物体内酸、碱环境的损害和酶的降解；所述纳米载体的递送作用能促进瓢虫肠道内的dsRNA穿透肠壁细胞进入体腔、组织和细胞，同时也能促进体表均匀本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培育不飞行瓢虫的方法，其特征在于，采用基因干扰的方法，干扰瓢虫翅发育关键基因vestigial或ultrabithorax的表达，培育不飞行瓢虫。

【技术特征摘要】
1.一种培育不飞行瓢虫的方法，其特征在于，采用基因干扰的方法，干扰瓢虫翅发育关键基因vestigial或ultrabithorax的表达，培育不飞行瓢虫。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因干扰的方法为注射dsRNA，具体包括以下步骤：S1、利用dsRNA合成试剂盒合成瓢虫vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA；S2、对瓢虫幼虫注射vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述vestigial基因的dsRNA和ultrabithorax基因的dsRNA的注射量分别为10-100ng；所述瓢虫幼虫为4龄第1天的幼虫。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因干扰的方法为饲喂dsRNA/纳米载体，具体包括以下步骤：S1、利用dsRNA合成试剂盒合成瓢虫vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA；S2、将Vestigial基因的dsRNA或ultrabithorax基因的dsRNA与纳米载体溶液混合得到dsRNA/纳米载体，随后将dsRNA/纳米载体与人工饲料混匀得到瓢虫饲料；S3、采用瓢虫饲料饲喂瓢虫幼虫。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述vestigial基因的ds...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈杰，马中正，王丹，刘小侠，尹梅贞，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11