大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列技术

本发明专利技术公开了大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列。本发明专利技术筛选出的21对大熊猫微卫星多态位点特异引物序列，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.42所示。鉴定大熊猫微卫星多态位点的方法利用大熊猫基因组筛选出微卫星位点并设计高质量引物；将大熊猫基因组测序read数据比对到大熊猫参考基因组鉴定INDEL，将INDEL鉴定结果与微卫星位点筛选结合，筛选出具有多态性的微卫星位点及高质量引物。本发明专利技术所提供的21对微卫星引物，均为多态性位点，具有较强的分辨能力。利用这套微卫星引物，可经济、快速、正确地进行大熊猫个体鉴定和亲子关系鉴定，有助于对大熊猫种群进行家族谱系重建和信息完善，为制定科学的大熊猫保护方案提供数据支持。

【技术实现步骤摘要】
大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列
本专利技术属于大熊猫微卫星多态位点鉴定领域，具体涉及大熊猫卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列。技术背景大熊猫是我国特有的濒危物种，是国家一级保护动物。大熊猫是一种古老的动物，曾经广泛分布于我国广大地区及东南亚地区，然而，随着人类文明对熊猫栖息地的严重破坏，大熊猫这一曾经广泛分布的物种也不得不退缩至现今的四川、陕西和甘肃三省，分布于秦岭、岷山、邛崃山、大相岭、小相岭和凉山等6个山系中，并各自或彼此间形成独特的进化历史。从上个世纪70年代末开始，我国各级有关部门逐步加大对大熊猫野外栖息地的保护力度，但由于各山系内部诸如铁路、公路、农田和人居等因素的干扰，大熊猫被分割为20多个极小种群，其仍然面临严重威胁。微卫星DNA是基因组中的短串联重复序列，又称为简单重复序列，由核心区和两侧的侧翼序列构成。核心序列是包含2-6个核苷酸的重复单元，重复次数可为5-100次，核心序列的重复数越大，微卫星的变异性越大，其等位基因数目就越多。侧翼序列则使微卫星序列特异地锚定于基因组中的某一位置。由于微卫星DNA具有位点数量多、在基因组中分布均匀、多态信息含量高、在单个微卫星位点可以做共显性等位基因分析、易于分析等特点，它已成为分子生态、分子进化、遗传育种以及保护遗传学等研究领域中最为重要的分子标记之一。近年来，随着对濒危动物保护遗传学研究日益受到重视，微卫星分子标记被用于个体身份鉴定、亲自关系鉴定、物种的进化历史、种群的扩散模式、种群遗传机构和遗传分化等保护遗传学问题。这些研究所得的数据为制定物种保护策略的提供可靠依据，证实了微卫星分子标记在保护遗传学研究所起的重要作用，微卫星位点多态性的高低在一定程度上反映了物种所面临的生存困境。尽管如此，目前的微卫星分子标记在使用上仍然有一些不足。例如，虽然有研究发现微卫星DNA侧翼序列在近缘物种间具有一定的保守性，然而对一些珍稀物种，尤其是在进化上地位特殊的物种来说，当缺乏相关近缘物种微卫星序列信息参考的情况下，则需要进行微卫星微点的筛选和特异引物的开发。而且，濒危物种普遍具有较低的遗传多样性，因此获得多态性的微卫星位点的显得更困难而且更重要。幸运的是，越来越多的物种的参考基因组已经完成测序并发布，这为我们在全基因组水平上大批量得获取微卫星数据提供方便。然而，前人使用物种参考基因组筛选微卫星的方法，存在两方面的缺陷：1、引物设计特异性较差，容易产生非特异性扩增；2、筛选的位点多态性较低,后续需要花费较多的时间和成本进行进一步筛选。本专利技术利用已经公开的大熊猫参考基因组序列，通过多轮比对筛选，确保引物具有较高特异性；同时使用可公开获取的基因组测序原始序列进行比对筛选，使用一个个体的基因组数据，便可获得多态性更高的大熊猫微卫星位点信息并设计特异引物。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供了大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列。本专利技术公开了一种大熊猫微卫星多态位点的鉴定方法，包括如下步骤：1)利用大熊猫参考基因组筛选出微卫星位点，并经过多轮的引物设计和筛选流程，针对大熊猫微卫星位点序列设计PCR扩增引物；2)并将大熊猫基因组测序read数据比对到大熊猫参考基因组，鉴定大熊猫基因组上的INDEL位点；3)根据大熊猫INDEL鉴定结果与大熊猫微卫星鉴定结果，筛选出具有多态性的大熊猫微卫星位点及相应的PCR扩增引物。优选的，所述利用大熊猫参考基因组筛选微卫星位点的过程具体为：鉴定大熊猫基因组上的微卫星(SSR)序列，对于重复单元为2-6bp的微卫星序列的基序(motif)需满足如下要求：对于二碱基的基序，要求其重复次数大于或等于6次；对于三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的基序，其重复单元的重复次数要求大于或等于4次；由此鉴定大熊猫基因组上的微卫星序列，并提取微卫星核心序列左右两侧各150bp的侧翼序列。优选的，所述的步骤1)中，对于筛选得到的PCR扩增引物对，如果PCR扩增引物对中的任何一条引物包含核心序列，则过滤掉该PCR扩增引物对及其对应的微卫星位点。更进一步的，所述的步骤1)还包括如下步骤：通过blastn将经过筛选得到的候选微卫星点序列的引物序列比对回大熊猫参考基因组，blastn参数为：-FF-b10000-v10000；对于比对到大熊猫参考基因组的引物对序列，要求5’端的错配不超过3个碱基，3’端的错配不超过1个碱基；对不满足条件的引物对序列进行过滤；挑选位于同一条scaffold上的引物序列，且要求这些引物对的正向引物和反向引物不存在overlap；保留在大熊猫基因组上存在唯一位置的引物对序列；如果引物对序列在基因组上有多个位置信息且这些引物产生的最终产物序列长度与之前微卫星产物长度的差大于2000bp，那么这样的引物对序列也保留下来。更进一步的，所述的步骤1)还包括如下步骤：根据得到的引物位置信息，提取其在大熊猫基因组上的产物序列，并将这些产物序列用SSRIT重新进行微卫星预测，如果基于某一个位置的产物序列有多种微卫星序列，则过滤掉这类引物序列，从而得到的结果是每个引物都能扩增产生唯一类型的微卫星序列。优选的，所述的步骤2)具体为：将大熊猫基因组测序read数据通过SOAP软件比对到大熊猫参考基因组，比对参数如下：-min100–max900–gap30–mis3，得到SOAP比对的结果文件；将上一步比对的结果文件作为输入，使用SOAPInDel软件，得到该个体的INDEL位点信息。优选的，所述的步骤3)之后还包括步骤4)，所述的步骤4)为利用实验方法对引物有效性和微卫星位点多态性进行鉴定和筛选；所述的实验方法为利用PCR技术检测，检验引物的灵敏度和特异性，保留扩增条带单一、清晰、明亮且条带大小符合预期的微卫星位点及相应的PCR扩增引物；利用单链构象多态性技术或荧光扫描技术中的一种或两种技术分析位点的多态性，保留多态的微卫星位点及相应的PCR扩增引物。本专利技术所提供的21对微卫星引物，均为多态性位点，具有较强的分辨能力。利用这套微卫星引物，可经济、快速、正确地进行大熊猫个体鉴定和亲子关系鉴定，有助于对大熊猫种群进行家族谱系重建和信息完善，为制定科学的大熊猫保护方案提供数据支持。附图说明图1显示的是第一对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图2显示的是第二对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图3显示的是第三对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图4显示的是第四对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图5显示的是第五对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图6显示的是第六对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图7显示的是第七对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图8显示的是第八对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图9显示的是第九对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图10显示的是第十对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图11显示的是第十一对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图12显示的是第十二对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图13显示的是第十三对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图14显示的是第十四对引物扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。图15显示的是第十五对引物扩增的微卫星位点片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大熊猫微卫星多态位点的鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：1)利用大熊猫参考基因组筛选出微卫星位点，并针对大熊猫微卫星位点序列设计PCR扩增引物；2)将大熊猫基因组测序read数据比对到大熊猫参考基因组，鉴定大熊猫基因组上的INDEL位点；3)根据大熊猫INDEL鉴定结果与大熊猫微卫星鉴定结果，筛选出具有多态性的大熊猫微卫星位点及相应的PCR扩增引物。

【技术特征摘要】
1.一种大熊猫微卫星多态位点的鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：1)利用大熊猫参考基因组筛选出微卫星位点，并针对大熊猫微卫星位点序列设计PCR扩增引物；2)将大熊猫基因组测序read数据比对到大熊猫参考基因组，鉴定大熊猫基因组上的INDEL位点；3)根据大熊猫INDEL鉴定结果与大熊猫微卫星鉴定结果，筛选出具有多态性的大熊猫微卫星位点及相应的PCR扩增引物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述利用大熊猫参考基因组筛选微卫星位点的过程具体为：鉴定大熊猫基因组上的微卫星序列，对于重复单元为2-6bp的微卫星序列的基序需满足如下要求：对于二碱基的基序，要求其重复次数大于或等于6次；对于三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的基序，其重复单元的重复次数要求大于或等于4次；由此鉴定大熊猫基因组上的微卫星序列，并提取微卫星核心序列左右两侧各150bp的侧翼序列。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的步骤1)中，对于筛选得到的PCR扩增引物对，如果PCR扩增引物对中的任何一条引物包含核心序列，则过滤掉该PCR扩增引物对及其对应的微卫星位点。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于还包括如下步骤：通过blastn将经过筛选得到的候选微卫星点序列的引物序列比对回大熊猫参考基因组，blastn参数为：-FF-b10000-v10000；对于比对到大熊猫参考基因组的引物对序列，要求5’端的错配不超过3个碱基，3’端的错配不超过1个碱基；对不满足条件的引物对序列进行过滤；挑选位于同一条scaffold上的引物序列，且要求这些引物对的正向引物和反向引物不存在重叠；保留在大熊猫基因组上存在唯一位置的引物对序列；如果引物对序列在基因组上有多个位置信息且这些引物产生的最终产物序列长度与之前微卫星产物长度的差大于2000bp，那么这样的引物对序列也保留下来。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于还包括如下步骤：根据得到的引物位置信息，提取其在大熊猫基因组上的产物序列，并将这些产物序列用SSRIT重新进行微卫星预测，如果基于某一个位置的产物序列有多种微卫星序列，则过滤掉这类引物序列，从而得到的结果是每个引物都能扩增产生唯一类型的微卫星序列。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2)具体为：将大熊猫基因组测序read数据通过SOAP软件比对到大熊猫参考基因组，比对参数如下：-min100–max900–gap30–mis3，得到SOAP比对的结果文件；将上一步比对的结果文件作为输入，使用SOAPInDel软件，得到该个体的INDEL位点信息。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3)之后还包括步骤4)，所述的步骤4)为利用实验方法对引物有效性和微卫星位点多态性进行鉴定和筛选；所述的实验方法为利用PCR技术检测，检验引物的灵敏度和特异性，保留扩增条带单一、清晰、明亮且条带大小符合预期的微卫星位点及相应的PCR扩增引物；利用单链构象多态性技术或荧光扫描技术中的一种或两种技术分析位点的多态性，保留多态的微卫星位点及相应的PCR扩增引物。8.一种大熊猫微卫星多态位点的引物对，其特征在于为下述21对引物对中的任一对，引物对的引物序列如下：引物对一：上游引物如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：方盛国，万秋红，林剑青，夏金全，光宣敏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33