【技术实现步骤摘要】
大熊猫微卫星多态位点、鉴定方法和引物序列
本专利技术属于大熊猫微卫星多态位点鉴定领域,具体涉及大熊猫卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列。技术背景大熊猫是我国特有的濒危物种,是国家一级保护动物。大熊猫是一种古老的动物,曾经广泛分布于我国广大地区及东南亚地区,然而,随着人类文明对熊猫栖息地的严重破坏,大熊猫这一曾经广泛分布的物种也不得不退缩至现今的四川、陕西和甘肃三省,分布于秦岭、岷山、邛崃山、大相岭、小相岭和凉山等6个山系中,并各自或彼此间形成独特的进化历史。从上个世纪70年代末开始,我国各级有关部门逐步加大对大熊猫野外栖息地的保护力度,但由于各山系内部诸如铁路、公路、农田和人居等因素的干扰,大熊猫被分割为20多个极小种群,其仍然面临严重威胁。微卫星DNA是基因组中的短串联重复序列,又称为简单重复序列,由核心区和两侧的侧翼序列构成。核心序列是包含2-6个核苷酸的重复单元,重复次数可为5-100次,核心序列的重复数越大,微卫星的变异性越大,其等位基因数目就越多。侧翼序列则使微卫星序列特异地锚定于基因组中的某一位置。由于微卫星DNA具有位点数量多、在基因组中分布均匀、多态信息含量高、在单个微卫星位点可以做共显性等位基因分析、易于分析等特点,它已成为分子生态、分子进化、遗传育种以及保护遗传学等研究领域中最为重要的分子标记之一。近年来,随着对濒危动物保护遗传学研究日益受到重视,微卫星分子标记被用于个体身份鉴定、亲自关系鉴定、物种的进化历史、种群的扩散模式、种群遗传机构和遗传分化等保护遗传学问题。这些研究所得的数据为制定物种保护策略的提供可靠依据,证实了微卫星分 ...
【技术保护点】
1.一种大熊猫微卫星多态位点的鉴定方法,其特征在于包括如下步骤:1)利用大熊猫参考基因组筛选出微卫星位点,并针对大熊猫微卫星位点序列设计PCR扩增引物;2)将大熊猫基因组测序read数据比对到大熊猫参考基因组,鉴定大熊猫基因组上的INDEL位点;3)根据大熊猫INDEL鉴定结果与大熊猫微卫星鉴定结果,筛选出具有多态性的大熊猫微卫星位点及相应的PCR扩增引物。
【技术特征摘要】
1.一种大熊猫微卫星多态位点的鉴定方法,其特征在于包括如下步骤:1)利用大熊猫参考基因组筛选出微卫星位点,并针对大熊猫微卫星位点序列设计PCR扩增引物;2)将大熊猫基因组测序read数据比对到大熊猫参考基因组,鉴定大熊猫基因组上的INDEL位点;3)根据大熊猫INDEL鉴定结果与大熊猫微卫星鉴定结果,筛选出具有多态性的大熊猫微卫星位点及相应的PCR扩增引物。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述利用大熊猫参考基因组筛选微卫星位点的过程具体为:鉴定大熊猫基因组上的微卫星序列,对于重复单元为2-6bp的微卫星序列的基序需满足如下要求:对于二碱基的基序,要求其重复次数大于或等于6次;对于三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的基序,其重复单元的重复次数要求大于或等于4次;由此鉴定大熊猫基因组上的微卫星序列,并提取微卫星核心序列左右两侧各150bp的侧翼序列。3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于所述的步骤1)中,对于筛选得到的PCR扩增引物对,如果PCR扩增引物对中的任何一条引物包含核心序列,则过滤掉该PCR扩增引物对及其对应的微卫星位点。4.如权利要求3所述的方法,其特征在于还包括如下步骤:通过blastn将经过筛选得到的候选微卫星点序列的引物序列比对回大熊猫参考基因组,blastn参数为:-FF-b10000-v10000;对于比对到大熊猫参考基因组的引物对序列,要求5’端的错配不超过3个碱基,3’端的错配不超过1个碱基;对不满足条件的引物对序列进行过滤;挑选位于同一条scaffold上的引物序列,且要求这些引物对的正向引物和反向引物不存在重叠;保留在大熊猫基因组上存在唯一位置的引物对序列;如果引物对序列在基因组上有多个位置信息且这些引物产生的最终产物序列长度与之前微卫星产物长度的差大于2000bp,那么这样的引物对序列也保留下来。5.如权利要求4所述的方法,其特征在于还包括如下步骤:根据得到的引物位置信息,提取其在大熊猫基因组上的产物序列,并将这些产物序列用SSRIT重新进行微卫星预测,如果基于某一个位置的产物序列有多种微卫星序列,则过滤掉这类引物序列,从而得到的结果是每个引物都能扩增产生唯一类型的微卫星序列。6.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述的步骤2)具体为:将大熊猫基因组测序read数据通过SOAP软件比对到大熊猫参考基因组,比对参数如下:-min100–max900–gap30–mis3,得到SOAP比对的结果文件;将上一步比对的结果文件作为输入,使用SOAPInDel软件,得到该个体的INDEL位点信息。7.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述的步骤3)之后还包括步骤4),所述的步骤4)为利用实验方法对引物有效性和微卫星位点多态性进行鉴定和筛选;所述的实验方法为利用PCR技术检测,检验引物的灵敏度和特异性,保留扩增条带单一、清晰、明亮且条带大小符合预期的微卫星位点及相应的PCR扩增引物;利用单链构象多态性技术或荧光扫描技术中的一种或两种技术分析位点的多态性,保留多态的微卫星位点及相应的PCR扩增引物。8.一种大熊猫微卫星多态位点的引物对,其特征在于为下述21对引物对中的任一对,引物对的引物序列如下:引物对一:上游引物如SEQI...
【专利技术属性】
技术研发人员:方盛国,万秋红,林剑青,夏金全,光宣敏,
申请(专利权)人:浙江大学,
类型:发明
国别省市:浙江,33
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