检测十种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因方法及所用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒，其包括对10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因进行特异性扩增的扩增引物组合，还包括检测10种不同甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的特异性探针。本发明专利技术还同时公开了利用该试剂盒进行的检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法。本发明专利技术所述的检测甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法及其试剂盒，具有集成化程度高、灵敏度高、特异性好，检测结果稳定可靠，成本低的特点，可广泛用于甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的分布、流行病学监测，为合理用药，有效降低和延缓耐药的发生提供有效工具。

【技术实现步骤摘要】
检测十种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因方法及所用试剂盒
本专利技术涉及一种检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法及其试剂盒。
技术介绍
一、甲氧苄胺嘧啶类药物及其作用机制：甲氧苄胺嘧啶(Trimethoprin，TMP)是一类合成抗菌剂。第一种TMP化合物1962年在英国首次使用。由于TMP-SUL的组合在体外实验中显示出具有协同作用，自1968年以来，TMP常与磺胺(Sulfonamide，SUL)类药物联合使用。然而，临床经验表明，TMP-SUL组合在体内并没有明显的协同作用。自20世纪70年代开始单独使用TMP，首先用于预防尿路感染，然后被用于治疗急性尿路感染。TMP能够与细菌内的二氢叶酸还原酶(DHFR；EC1.5.1.3)结合，抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸还原成四氢叶酸受阻。四氢叶酸对于叶酸合成是所必需的，而叶酸是形成核苷酸和氨基酸的重要前体。TMP通过抑制四氢叶酸形成达到抑菌目的。TMP有广泛的抗菌谱，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)其他成员、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、志贺氏菌(Shigellasp.)等等。这些病原菌可引起尿道、呼吸道、肠道疾病及皮肤疾病。由于临床适应症广泛，TMP类药物已广泛应用于世界各地。此外，由于这类合成化合物价格相对便宜，使得TMP在发展中国家和一些相对贫穷的国家中广泛使用。据报道，发展中国家革兰氏阴性病原体的TMP耐药率明显高于发达国家，南美洲，亚洲和非洲，TMP抗性处在25％至68％的高水平。同时，发展中国家显示出很高的TMP耐药肠杆菌的粪便携带水平。随着使用的范围扩大，以及使用中的一些不规范用药行为的增加，对TMP类药物的耐药已引起了国际上的广泛重视。二、细菌对甲氧苄胺嘧啶类药物的耐药机制：细菌对TMP的抗性机制可分为染色体抗性和质粒携带的抗性。质粒介导的TMP抗性首先在1972年被发现，Pattishall等人发现介导TMP抗性的质粒携带的DHFR(相对于染色体编码的看家DHFR，称为辅助DHFR，由dfr基因编码)。TMP抗性基因使用复杂的转移机制，包括位点特异性重组水平遗传交换，在不同病原菌中传播TMP抗性基因。转座子Tn7、整合子、插入因子(IS)以及广宿主范围的小质粒是携带和转移辅助DHFR的重要载体。根据抗生素综合耐药数据库(TheComprehensiveAntibioticResistanceDatabase，CARD)分析整理，目前在不同细菌中已经发现了30种不同的辅助dfr基因类型，其中包括20种dfrA基因和10种非dfrA类的TMP耐药基因(dfrB1、dfrB2、dfrB3、dfrB6、dfrC、dfrD、dfrE、dfrF、dfrG和dfrK)，其中dfrB类基因多分布于假单胞菌、克雷伯氏菌和沙门氏菌，以及一些尚未能培养的革兰氏阴性菌中，dfrC–dfrG型TMP耐药基因多分布于葡萄球菌、肠球菌、李斯特氏菌，以及链球菌等革兰氏阳性菌中。三、甲氧苄胺嘧啶类药物的耐药检测方法：目前细菌对甲氧苄胺嘧啶类药物耐药性的检测方法有两类，即表型检测和基因型检测。表型检测通过分离纯化样品中的病原菌后，在TMP药物存在的情况下再次培养病原菌，通过抑菌圈大小，或测定半致死药物浓度(MIC50)进行；而基因型检测则通过分子生物学方法，检测细菌是否携带与甲氧苄胺嘧啶类药物耐药性相关的基因。表型检测步骤复杂，耗时长，整个过程至少需48-72小时，病原菌分离培养过程中，由于没有抗生素选择压力，可能使质粒等携带的TMP抗性基因发生丢失，导致后续的药物敏感性检测得出假阴性的结果。基因型检测的优点是可提供基因水平的耐药信息，可在样品收集后24小时内得到结果，技术步骤较少，一般情况下费用较便宜。表型耐药检测的结果与基因型检测结果通常相同，但有时亦有差异。而大量的临床实践表明，如果基因型检测到耐药基因，即使表型检测显示为敏感，仍有很大可能获得用药失败的结果。这种现象是由于表型检测得到的假阴性结果，而实际上细菌携带耐药基因，用药后在药物选择压力下很快成为优势菌株，使得用药失败。有鉴于此，国际上越来越多的细菌耐药性研究者和临床医生建议参考基因型检测结果，基因型检测到相关耐药基因，即使药敏试验实验结果为敏感，仍不建议使用相应抗生素，以尽可能延缓和减弱细菌对抗生素耐药的发生和发展。基因型检测虽然结果准确，但是其只能检测已知序列的耐药基因，而对未发现过的新型耐药基因，由于基因序列未知而无法针对性设计特异性引物和探针而无法检测。与此相反，表型检测由于直接检测菌株在药物选择压力下的生存状况，因而针对新型耐药基因引起的耐药仍有可能获得阳性检测结果。因此，基因型检测仍需要结合表型检测结果，才能进行综合判断。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、快速、成本低的检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因(表1)的方法及其试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒：包括对10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因进行特异性扩增的扩增引物组合，其序列如SEQIDNO:1-20所示；还包括检测10种不同甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的特异性探针，其序列如SEQIDNO:21-30所示。作为本专利技术的检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒的改进：特异性探针固定于载体上；所述载体为以下任一：硅片、用各种功能基团衍生的膜，用各种功能基团修饰的玻片载体(优选为醛基基团修饰的玻片)。作为本专利技术的检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒的进一步改进：所述试剂盒还包括PCR扩增反应液和杂交反应液(即，PCR扩增、杂交反应所需要的反应液)。本专利技术还同时提供了利用上述试剂盒进行的检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法，包括以下步骤：1)、利用试剂盒包含的扩增引物组合和PCR扩增反应液，对待测样品中可能存在的包含在待测的10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因中的至少一种(任何一种和几种基因区段)进行不对称扩增，同时对PCR产物进行荧光标记；2)、将步骤1)所得的扩增产物与试剂盒中的杂交反应液混合，再与特异性探针进行杂交；经扫描(扫描仪可根据固定特异性探针的载体及PCR产物标记的类型确定)获得每个特异性探针的信号值、背景值(均为灰度值)；计算每条特异性探针的信噪比：信噪比＝(信号值-背景值)/背景值；当信噪比大于等于3时，判定该探针所对应的基因检测结果为阳性，如所有特异性探针信噪比均小于3，则判定该待测样品中不包含待测的10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因。作为本专利技术的检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法的改进：待测的10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因为：dfrB1、dfrB2、dfrB3、dfrB6、dfrC、dfrD、dfrE、dfrF、dfrG和dfrK。具体如下表1所示。表1.10种待检测的甲氧苄胺嘧啶类药物的耐药基因本专利技术的试剂盒包括对10种耐药基因区段进行特异性扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒，其特征是：包括对10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因进行特异性扩增的扩增引物组合，其序列如SEQ ID NO:1‑20所示；还包括检测10种不同甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的特异性探针，其序列如SEQ ID NO:21‑30所示。

【技术特征摘要】
1.检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒，其特征是：包括对10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因进行特异性扩增的扩增引物组合，其序列如SEQIDNO:1-20所示；还包括检测10种不同甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的特异性探针，其序列如SEQIDNO:21-30所示。2.根据权利要求1所述的检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒，其特征是：特异性探针固定于载体上；所述载体为以下任一：硅片、用各种功能基团衍生的膜，用各种功能基团修饰的玻片载体。3.根据权利要求1或2所述的检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的试剂盒，其特征是：所述试剂盒还包括PCR扩增反应液和杂交反应液。4.利用如权利要求1～3任一所述的试剂盒进行的检测10种甲氧苄胺嘧啶类药物耐药基因的方法，其特征是包括以下步骤：1)、利用试剂盒包含的扩增引...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琼，李兰娟，项春生，刁宏燕，刘芳，孟晓华，姚坚，周佳维，吴灵娇，倪淑君，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33