miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种miRNA捕获探针、miRNA分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒。所述miRNA捕获探针包括磁珠和固定在磁珠上的环形探针；所述磁珠上固定有单链DNA探针；所述环形探针包括miRNAs的互补序列和单链DNA探针的杂交序列。所述检测方法包括以下步骤：(1)制备miRNA捕获探针；(2)使用miRNA捕获探针对miRNA进行识别和捕获；(3)捕获的miRNA作为引物触发滚环扩增；(4)荧光信号检测。本发明专利技术提供的miRNA捕获探针、miRNA分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒无需提取总RNA，是一种简单，高效，低成本的miRNAs检测方法，对肿瘤的早期筛查及生命科学的基础研究等有一定的实际意义。

【技术实现步骤摘要】
miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒
本专利技术涉及肿瘤检测
，具体涉及一种miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
miRNAs是一类短链，内源的非编码RNA，在基因表达中起着重要的调控作用，参与了细胞增殖，分化，凋亡等生理过程。包括癌症在内的许多疾病与miRNAs异常表达有关，因此，miRNAs是一种很有潜力的肿瘤早期筛查和治疗的生物标记物。高效灵敏的miRNAs分析方法在临床诊断中有十分重要的意义。目前，用于miRNAs检测的传统方法有Northern印迹法，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，微阵列法等。Northern印迹法操作步骤繁琐，耗时较长，检测灵敏度低；反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和微阵列法检测灵敏度较好，但是需要昂贵的仪器，检测成本较高。针对这些问题，出现了许多新的检测方法，如电化学和光学传感器，实现了miRNAs的快速灵敏，低成本检测。但是，为了获得高的灵敏度，这些体系通常结合了多种信号放大技术，导致体系的稳定性和可靠性不能满足实际样本检测的要求。实际样本的组成通常比较复杂，包含了多种蛋白，核酸，及其它类型的组分，对miRNAs的检测有很大的干扰。因此，目前发展的miRNAs检测技术通常需要首先提取总RNA。这不仅浪费时间和人力，而且miRNAs在提纯的过程中会有降解和损失。因此，发展简便可靠，能够实现miRNAs高效分离和信号放大的一体化检测技术，对于以miRNAs为生物标记物的疾病诊断有重要意义。磁分离是一种简便高效的分子分离技术，广泛应用于商品化试剂盒和基础研究中；经过捕获分子功能化的磁珠能够识别并特异性地结合靶标分子，从而实现复杂基质中特定靶标的快速高效分离；滚环扩增是一种设计简单，应用广泛的等温扩增技术，能够在恒定温度下实现核酸快速扩增和信号放大，尤其适用于短链DNA或RNA，例如miRNAs。公开号为CN103555838A的专利文献提供了一种基于滚环扩增反应的miRNA检测探针、检测方法及试剂盒。本专利技术提供的探针包括发卡探针和环形探针，发卡探针依次包括5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)，5’端侧链(1)、环区(2)以及3’端侧链(3)均为单链核苷酸，其中，5’端侧链(1)和环区(2)具有与待测miRNA互补的核苷酸序列，5’端侧链(1)和3’端侧链(3)的部分核苷酸序列互补，3’端侧链(3)具有与环形探针的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列；本专利技术提供的miRNA检测方法，能区分待测miRNA、与靶标序列相似的miRNA、及目标miRNA前体；且检测血液样品时不需要miRNA抽提和纯化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒。本专利技术提供的miRNA捕获探针、检测方法及检测试剂盒可以实现miRNAs高效分离和扩增一体化检测，所述检测方法无需提取总RNA，是一种简单，高效，低成本的miRNAs检测方法，对肿瘤的早期筛查及生命科学的基础研究等有一定的实际意义。本专利技术提供如下技术方案：一种miRNA捕获探针，所述miRNA捕获探针包括磁珠和固定在磁珠上的环形探针；所述磁珠上固定有单链DNA探针；所述环形探针包括miRNAs的互补序列和单链DNA探针的杂交序列。在miRNA捕获探针中，所述的单链DNA探针通过与环形序列中单链DNA探针的杂交序列杂交，从而将环形探针固定在磁珠上。所述miRNAs的互补序列用于miRNA的识别和捕获。所述单链DNA探针的一端用生物素标记，所述磁珠用链霉亲和素包被；所述单链DNA探针通过生物素和链霉亲和素之间特异性的亲和力固定在磁珠上。所述单链DNA探针的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述环形探针的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供一种使用上述miRNA捕获探针对miRNA分离扩增一体化的检测方法，包括以下步骤：(1)配置环形探针和生物素标记的单链DNA探针的杂交溶液，加入链霉亲和素包被的磁珠，得到miRNA捕获探针；(2)使用miRNA捕获探针对miRNA进行识别和捕获；(3)捕获的miRNA作为引物触发滚环扩增，通过链置换扩增反应转移到滚环扩增反应液进行扩增；(4)磁分离去除磁珠后，在扩增后的反应液中加入荧光染料，蓝光激发发出荧光信号，拍照成像，读取图像的灰度值实现定量检测。滚环扩增反应液中的酶反应速率显著高于固相表面，因此可以获得较高的扩增效率。通过磁分离可以尽可能去除干扰物质的影响。本专利技术还提供一种使用上述miRNA捕获探针及miRNA分离扩增一体化的检测方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：(1)miRNA捕获探针；(2)包含有30％甲酰胺的PBS清洗液；(3)滚环扩增反应液；(4)包含200mMEDTA(乙二胺四乙酸)和10×Evagreen的终止液。所述的滚环扩增反应液包括20-30μL双蒸水ddH2O、3μL聚合酶缓冲液、0.3-0.5μL脱氧核糖核苷三磷酸和0.3-0.5μLDNA聚合酶。脱氧核糖核苷三磷酸和DNA聚合酶的含量将会影响扩增效率和特异性。本专利技术提供的miRNA捕获探针、分离扩增一体化的检测方法及检测试剂盒，通过将环形探针固定在磁珠上，通过滚环扩增实现信号放大，通过磁分离可以尽可能去除干扰物质的影响，提高精度，能够实现miRNAs高效分离和扩增一体化检测，荧光信号的检测体系操作简单，所需仪器设备简单，无需提取总RNA，是一种便捷，低成本的miRNAs检测方法。附图说明图1为本专利技术提供的miRNA捕获探针的结构示意图；图2为本专利技术提供的miRNA分离扩增一体化的检测方法的原理示意图；图3为本专利技术提供的miRNA分离扩增一体化的检测方法的流程示意图；图4为检测不同浓度miR-21的荧光强度；图5为分别检测miR-let-7a,miR-141,miR-155,miR-21存在时的荧光强度信号；图6为单碱基，三个碱基，五个碱基错配链，miR-21存在时的荧光强度信号；图7为直接检测MCF-7和L02细胞裂解液中的miR-21；图8为检测不同细胞数目的MCF-7细胞裂解液中的miR-21。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的具体实施例进行详细说明。如图1所示，本专利技术提供的miRNA捕获探针包括磁珠1和固定在磁珠1上的环形探针2；所述磁珠上固定有单链DNA探针11；所述环形探针包括miRNAs的互补序列21和单链DNA探针的杂交序列22。在miRNA捕获探针中，所述的单链DNA探针11通过与环形序列中的单链DNA探针的杂交序列22杂交，从而将环形探针2固定在磁珠1上。所述miRNAs的互补序列21用于miRNA的识别和捕获。所述单链DNA探针11的3＇端用生物素标记，所述磁珠1用链霉亲和素包被；所述单链DNA探针11通过生物素和链霉亲和素之间特异性的亲和力固定在磁珠1上。单链DNA探针11的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。图2为本专利技术提供的miRNA分离扩增一体化的检测方法的原理示意图；其中1为磁珠，2为生物素标记单链DNA，3为环形探针，4为待测miRNA，5为干扰核酸，6为Phi29DNA聚合酶，7为滚环扩增产物，8为Evagreen染料。如图3所示，本专利技术提供的miRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miRNA捕获探针，其特征在于，所述miRNA捕获探针包括磁珠和固定在磁珠上的环形探针；所述磁珠上固定有单链DNA探针；所述环形探针包括miRNAs的互补序列和单链DNA探针的杂交序列。

【技术特征摘要】
1.一种miRNA捕获探针，其特征在于，所述miRNA捕获探针包括磁珠和固定在磁珠上的环形探针；所述磁珠上固定有单链DNA探针；所述环形探针包括miRNAs的互补序列和单链DNA探针的杂交序列。2.根据权利要求1所述的miRNA捕获探针，其特征在于，所述单链DNA探针的一端用生物素标记，所述磁珠用链霉亲和素包被；所述单链DNA探针通过生物素和链霉亲和素之间特异性的亲和力固定在磁珠上。3.根据权利要求1所述的miRNA捕获探针，其特征在于，所述单链DNA探针的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。4.根据权利要求1所述的miRNA捕获探针，其特征在于，所述环形探针的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。5.一种使用权利要求1所述的miRNA捕获探针对miRNA分离扩增一体化的检测方法，包括以下步骤：(1)配制环形探针和生物素标记的单链DNA探针的杂交溶液，加入链霉亲和素包被的磁珠，得到miRNA捕获探针；(2)使用miRNA捕获探针对miRNA进行识别和捕获；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚波，路威，王敏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33