一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法技术

技术编号:19159570 阅读:36 留言:0更新日期:2018-10-13 12:36
本发明专利技术公开了一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,所述方法为:将待测菌株经发酵培养获得的湿菌体作为待测菌株样品加入底物反应液中,摇床反应液离心,获得上清液;取上清液加入显色反应液中,室温静置显色,在465nm处测吸光值,根据丙酮酸钠标准曲线,获得上清液中丙酮酸钠的含量,进而获得待测菌株样品中酪氨酸酚裂解酶的活力,从而筛选出酪氨酸酚裂解酶高活力菌株;本发明专利技术方法,可以直接高通量筛选获得对左旋多巴合成能力提高的酪氨酸酚裂解酶及其突变体,时间从分析一个样品需要20min,缩短到分析近60个样只需1min,所测得的酶活误差控制在3%以内。

【技术实现步骤摘要】
一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法(一)
本专利技术涉及一种高通量筛选对左旋多巴合成能力提高的酪氨酸酚裂解酶及其突变体的方法。(二)
技术介绍
酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenol-lyase,TPL)又名β-酪氨酸酶,它是一类磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’-phosphate,PLP)依赖型裂解酶。TPL能够催化L-酪氨酸发生α,β-消去反应,生成丙酮酸、苯酚和氨。此反应为可逆反应,若以邻苯二酚替代苯酚,该酶可催化生成左旋多巴,其催化机理可以用下式表示:左旋多巴是生物有机体中重要的活性物质,是治疗帕金森氏病的主要药物。其治疗帕金森氏病的原理为:左旋多巴的衍生物─多巴胺是治疗帕金森氏病的一种重要的神经递质,但它不能够通过血脑屏障,因此不能通过外在补充多巴胺来治疗帕金森氏病,而左旋多巴能够通过血脑屏障,到达中枢神经系统,并在体内脱羧酶的作用下,转变为多巴胺,从而使脑组织中多巴胺含量增加,进而发挥治疗帕金森综合症的作用。鉴于左旋多巴植物提取方法产能不稳定、步骤复杂,化学合成工序多、成本高、环境污染严重,微生物法合成左旋多巴越来越受到关注。酪氨酸酚裂解酶催化邻苯二酚,丙酮酸和氨合成左旋多巴具有反应条件温和、原子经济性高等显著优势。随着基因工程技术的快速发展,通过酶高通量筛选、分子改造等技术,可以有效提高酪氨酸酚裂解酶催化合成左旋多巴的效率。由于自然界中存在的酪氨酸酚裂解酶种类繁多,酶分子改造所获得的突变文库突变体数量巨大(通常含104~106突变体),通过传统的色谱等检测手段很难高效地筛选获得催化性能提高的酪氨酸酚裂解酶。因此,建立快速、准确的酪氨酸酚裂解酶高通量筛选方法具有重要意义。(三)
技术实现思路
本专利技术为了克服筛选高活力酪氨酸酚裂解酶周期长、工作量大等难题,提供了一种基于深孔板的微型化培养与基于酶标仪微量化检测的高通量酪氨酸酚裂解酶筛选方法,其机理如下:参与左旋多巴合成的底物丙酮酸钠在强碱溶液中与水杨醛生成一种显色的1,5-双(2-羟苯基)-1、4-戊二烯酮产物,在465nm波长有吸收值。随着丙酮酸钠浓度的降低,颜色从橘红色变为淡黄色。若酪氨酸酚裂解酶的活力越低,说明其合成左旋多巴的能力越弱,丙酮酸钠的剩余浓度越大,则显色反应液颜色越深,若酪氨酸酚裂解酶的活力越高,说明其合成左旋多巴的能力越强,丙酮酸钠的剩余浓度越小,显色反应液颜色越浅。本专利技术采用的技术方案是:本专利技术提供一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,所述方法为:(1)转化反应:将待测菌株(优选含酪氨酸酚裂解酶基因的待测菌株)经发酵培养获得的湿菌体作为待测菌株样品加入底物反应液中,在10-30℃、100-300rpm摇床反应20-120min(优选1MHCl或于95℃下放置5-10min终止反应),将反应液离心,获得上清液;所述底物反应液终浓度组成为:邻苯二酚2-15g/L,丙酮酸钠2-20g/L,乙酸铵5-50g/L,亚硫酸钠0.1-2g/L,EDTA-2Na0.1-2g/L,磷酸吡哆醛(PLP)0.2-2mM,pH7.0-8.0,溶剂为超纯水;(2)显色反应:取步骤(1)上清液加入显色反应液中,室温静置显色,在465nm处测吸光值,根据丙酮酸钠标准曲线,获得上清液中丙酮酸钠的含量,进而获得待测菌株样品中酪氨酸酚裂解酶的活力,从而筛选出对左旋多巴合成能力提高的酪氨酸酚裂解酶高活力菌株;所述显色反应液由10-250g/L氢氧化钠水溶液与水杨醛和超纯水以体积比3:0.1~3:5-10组成;所述标准曲线是在待测菌株检测相同条件下,将底物反应液与含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌转化反应后的上清液进行显色反应,以丙酮酸钠浓度为横坐标,以465nm处吸光值为纵坐标绘制而成。进一步,所述底物反应液终浓度组成为:邻苯二酚4-8g/L,丙酮酸钠4-10g/L,乙酸铵30-50g/L,亚硫酸钠0.5-1g/L,EDTA-2Na1-2g/L,磷酸吡哆醛0.5-1mM,pH7.0-8.0,溶剂为超纯水,更优选底物反应液终浓度组成为:邻苯二酚5g/L、丙酮酸钠5g/L、乙酸铵50g/L、亚硫酸钠1g/L、EDTA-2Na2g/L、PLP1mM,溶剂为超纯水。进一步,所述显色反应液由250g/L氢氧化钠水溶液与水杨醛和超纯水以体积比3:0.1:6.7组成。进一步,步骤(2)所述显色反应按如下步骤进行:先后分别加入1ml250g/LNaOH水溶液,200μL步骤(1)上清液,6.7ml超纯水,100μL水杨醛,2ml250g/LNaOH水溶液,混合均匀,构成10ml显色反应体系,室温静置显色,在465nm处测吸光值。进一步,所述丙酮酸钠标准曲线按如下方法制备:(1)转化反应:将含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌湿菌体加入底物反应液中,30℃、150rpm摇床反应5min-5h,定时取样(分别在10、20、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300min时取样)加入1MHCl终止反应后,于3000rpm离心10min,获得不同反应时间的上清液;所述底物反应液终浓度组成为:邻苯二酚5g/L、丙酮酸钠5g/L、乙酸铵50g/L、亚硫酸钠1g/L、EDTA-2Na2g/L、磷酸吡哆醛1mM,溶剂为超纯水,pH7.0-8.0;所述湿菌体加入终浓度为4g/L;(2)显色反应:依次加入1mL250g/LNaOH水溶液,200μL步骤(1)不同反应时间获得的上清液,6.7mL超纯水,100μL水杨醛,2mL250g/LNaOH水溶液,混合均匀,构成显色反应体系10mL,室温下放置2h,用酶标仪于465nm测定吸光度,以吸光度为纵坐标,以丙酮酸钠转化率为横坐标,获得丙酮酸钠标准曲线。进一步,所述含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌是将SEQIDNO.1所示核苷酸序列的基因导入大肠杆菌获得的。进一步,待测菌株发酵方法为:将待测菌株接种至发酵培养基,在20-37℃,100-300rpm摇床培养6-12h,获得湿菌体;所述发酵培养基组成为:蛋白胨5-20g/L,酵母粉2-10g/L,氯化钠2-10g/L,IPTG10-30g/L,溶剂为水,pH值自然。进一步,所述待测菌株在发酵前先进行种子活化培养,再将种子液以体积浓度2-5%的接种量接种至发酵培养基,所述种子活化培养方法为:将待测菌株接种至种子培养基,在30-37℃,100-300rpm摇床培养10-14h,获得种子液;所述种子培养基组成为:蛋白胨5-20g/L,酵母粉2-10g/L,氯化钠2-10g/L,卡那酶素50-100μg/mL,溶剂为水,pH值自然。进一步,所述方法在96孔板中进行反应,所述96孔板均为深孔板,深孔板的硅胶孔垫上孔与深孔板的深孔对应,保证各微孔独立地与外界交换空气。培养基装液量为深孔板孔体积的30%-50%,接种量是发酵培养基体积的20%-50%。进一步,所述方法为:(1)将待测菌株接种于装有种子培养基的深孔板Ⅰ中,于30-37℃,100-300rpm摇床培养10-14h,获得种子液;(2)将深孔板Ⅰ中的种子液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II中,于20-37℃,100-300rpm摇床培养6-12h本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述方法为:(1)转化反应:将待测菌株经发酵培养获得的湿菌体作为待测菌株样品加入底物反应液中,在10‑30℃、100‑300rpm摇床反应20‑120min,将反应液离心,获得上清液;所述底物反应液终浓度组成为:邻苯二酚2‑15g/L,丙酮酸钠2‑20g/L,乙酸铵5‑50g/L,亚硫酸钠0.1‑2g/L,EDTA‑2Na 0.1‑2g/L,磷酸吡哆醛0.2‑2mM,pH 7.0‑8.0,溶剂为超纯水;(2)显色反应:取步骤(1)上清液加入显色反应液中,室温静置显色,在465nm处测吸光值,根据丙酮酸钠标准曲线,获得上清液中丙酮酸钠的含量,进而获得待测菌株样品中酪氨酸酚裂解酶的活力,从而筛选出酪氨酸酚裂解酶高活力菌株;所述显色反应液由10‑250g/L氢氧化钠水溶液与水杨醛和超纯水以体积比3:0.1‑3:5‑10组成;所述标准曲线是在待测菌株检测相同条件下,将底物反应液与含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌转化反应后的上清液进行显色反应,以丙酮酸钠浓度为横坐标,以465nm处吸光值为纵坐标绘制而成。

【技术特征摘要】
1.一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述方法为:(1)转化反应:将待测菌株经发酵培养获得的湿菌体作为待测菌株样品加入底物反应液中,在10-30℃、100-300rpm摇床反应20-120min,将反应液离心,获得上清液;所述底物反应液终浓度组成为:邻苯二酚2-15g/L,丙酮酸钠2-20g/L,乙酸铵5-50g/L,亚硫酸钠0.1-2g/L,EDTA-2Na0.1-2g/L,磷酸吡哆醛0.2-2mM,pH7.0-8.0,溶剂为超纯水;(2)显色反应:取步骤(1)上清液加入显色反应液中,室温静置显色,在465nm处测吸光值,根据丙酮酸钠标准曲线,获得上清液中丙酮酸钠的含量,进而获得待测菌株样品中酪氨酸酚裂解酶的活力,从而筛选出酪氨酸酚裂解酶高活力菌株;所述显色反应液由10-250g/L氢氧化钠水溶液与水杨醛和超纯水以体积比3:0.1-3:5-10组成;所述标准曲线是在待测菌株检测相同条件下,将底物反应液与含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌转化反应后的上清液进行显色反应,以丙酮酸钠浓度为横坐标,以465nm处吸光值为纵坐标绘制而成。2.如权利要求1所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述底物反应液终浓度组成为:邻苯二酚4-8g/L,丙酮酸钠4-10g/L,乙酸铵30-50g/L,亚硫酸钠0.5-1g/L,EDTA-2Na1-2g/L,磷酸吡哆醛0.5-1mM,pH7.0-8.0,溶剂为超纯水。3.如权利要求1所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述显色反应液由250g/L氢氧化钠水溶液与水杨醛和超纯水以体积比3:0.1:6.7组成。4.如权利要求1所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于步骤(2)所述显色反应按如下步骤进行:先后分别加入1ml250g/LNaOH水溶液,200μL步骤(1)上清液,6.7ml超纯水,100μL水杨醛,2ml250g/LNaOH水溶液,混合均匀,构成10ml显色反应体系,室温静置显色,在465nm处测吸光值。5.如权利要求1所述含酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法,其特征在于所述丙酮酸钠标准曲线按如下方法制备:(1)转化反应:将含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌湿菌体加入底物反应液中,30℃、150rpm摇床反应5min-5h,定时取样加入1MHCl终止反应后,于3000rpm离心10min,获得不同反应时间的上清液;所述底物反应液终浓度组成为:邻苯二酚5g/L、丙酮酸钠5g/L、乙酸铵50g/L、亚硫酸钠1g/L、EDTA-2Na2g/L、磷酸吡哆醛1mM,溶剂为超纯水,pH7.0-8.0;所述湿菌体加入终浓度为4g/L;(2)显色反应:依次加入1mL250g/LNaOH水溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员:汤晓玲郑仁朝郑裕国索慧刘潇
申请(专利权)人:浙江工业大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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