一种三疣梭子蟹COMT基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种三疣梭子蟹COMT基因及应用，涉及三疣梭子蟹基因工程，该三疣梭子蟹COMT基因基因序列如SEQ NO.1所示，本发明专利技术还提供一种制备三疣梭子蟹三疣梭子蟹COMT基因重组蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建三疣梭子蟹COMT基因重组表达载体；(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；(3)将分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白；与现有技术相比，本发明专利技术具有如下优点：三疣梭子蟹COMT基因可能广泛参与了三疣梭子蟹攻击行为的分子机制，在继左旋多巴和多巴胺受体激动剂后推入临床治疗波动症的较新一类药物开发上显示出较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种三疣梭子蟹COMT基因及其应用
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种三疣梭子蟹COMT基因及其应用。
技术介绍
三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是最具经济重要性的海蟹之一，它广泛分布于中国沿海地区。随着人工养殖技术的发展，三疣梭子蟹养殖业发展迅速，然而，与其他甲壳类动物一样，三疣梭子蟹非常具有侵略性，并且表现出强大的地域性和同类相食性。大量三疣梭子蟹在培育和繁殖过程中因相互之间的争斗与应激行为造成的个体伤亡或受到损害，导致三疣梭子蟹在养殖过程中的成活率低，产量低。对争斗行为在神经生物学机制的研究发现，神经递质会影响水生动物的争斗行为，特别是单胺类递质如5-羟色胺、章鱼胺和多巴胺，其中5-羟色胺为重要的单胺类神经递质，与争斗性行为关系紧密。同样重要的胺类神经递质如儿茶酚-氧位-甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase，简称COMT)，是1958年首先在人体发现的一种转甲基酶，主要代谢儿茶酚型的化合物，COMT酶在有二价镁离子Mg2+存在时，催化S腺苷蛋氨酸(SAM)的一个甲基转移到底物DHBAc分子的一个羟基上，形成甲基化产物香草酸(VA)和异香草酸(IVA)的反应机理。如一申请号为201310591259.3的中国专利技术专利申请《中国对虾COMT重组蛋白的生产方法及其应用》(公开号为CN103602642A)里公开其克隆出了中国对虾的COMT基因，公开了该基因编码蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，同时，还重新设计了中国对虾COMT重组蛋白的生产方法，其直接用酵母液纯化，省去了原核菌体回收、破碎的繁琐步骤，提高了纯化效率，但并未对中国对虾的争斗行为作相应的研究，同时，基于先前的研究已经证实攻击性行为主要受甲壳动物神经系统中生物胺的调节。在甲壳类动物中，DA是一种广泛分布的生物胺神经递质，它调节许多生理功能。COMT是DA的主要代谢酶，它通过控制突触中DA的代谢来影响运动，情感和认知行为，其活动与侵略密切相关。DA的释放被认为是可以引发神经内分泌反应，促进或抑制甲壳动物生理过程，但很少有研究确定甲壳动物攻击行为的攻击相关基因和分子调控机制，尤其是COMT基因在攻击行为期间参与生物胺代谢的机制，包括DA，为此有必要对三疣梭子蟹相互之间的争斗与应激行为作进一步的研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种三疣梭子蟹的COMT基因。本专利技术所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种三疣梭子蟹的COMT基因的应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：该三疣梭子蟹COMT基因，其特征在于：所述三疣梭子蟹COMT基因的序列如SEQNO.1所示。所述的三疣梭子蟹COMT基因的氨基酸序列为：MetAlaThrThrValLysSerTyrSerSerGluAspProLeuLeuLysTyrThrValAspHisSerLeuArgLeuThrAspValGlnLysArgLeuAsnGluValThrPheLysHisSerArgTyrGlnMetLeuGlyAlaProGluValLeuGlnLeuAsnAlaAsnLeuIleGlnAlaIleGlyGlyLysLysValLeuAspValGlyValPheThrGlyAlaSerSerLeuSerAlaAlaLeuAlaLeuProProAspGlyGluValHisAlaLeuAspIleThrGluGluTyrProSerIleGlyLysProPheTrpAlaGluAlaGlyValAlaAspLysIleHisLeuHisIleAlaProAlaGlyGlnThrLeuGlnArgLeuIleAspGluGlyHisAlaGlySerPheAspPheAlaPheIleAspAlaAspLysProGlyTyrAspAspTyrTyrGluLysCysLeuValLeuLeuArgArgGlyGlyIleIleSerPheAspAsnThrValGlnAlaGlyArgValIleAspProAspAspGlnLysProAlaThrValAlaIleArgLysLeuAsnGluLysLeuArgAspAspGlnArgIleAsnLeuSerPheLeuLysIleAlaAspGlyLeuThrLeuCysPheIleLys。本专利技术为解决第二个技术问题提供了一种制备上述的三疣梭子蟹COMT基因重组蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建三疣梭子蟹COMT基因重组表达载体；(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；(3)将分离纯化步骤(2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即三疣梭子蟹COMT基因重组蛋白。优选地，在所述步骤(1)中的表达载体选用pET28a(+)。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌TOP10F'。本专利技术为解决第三个技术问题提供了一种制备上述的三疣梭子蟹COMT基因在制备COMT抑制剂中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利首次克隆出了三疣梭子蟹COMT基因，根据三疣梭子蟹COMT基因序列特征成功构建重组表达载体并在大肠杆菌系统中表达并纯化获得三疣梭子蟹COMT基因的重组蛋白，并作了相关的表达分析以及COMT与三疣梭子蟹攻击性行为之间的关系的研究，同时还分析了三疣梭子蟹COMT的组织分布和幼体发育阶段分布，并初步评估了COMT与多巴胺DA的关系，表明三疣梭子蟹COMT基因可能广泛参与了三疣梭子蟹攻击行为的分子机制，在继左旋多巴和多巴胺受体激动剂后推入临床治疗波动症的较新一类药物开发上显示出较好的应用前景。附图说明图1为本专利技术中三疣梭子蟹COMT全长cDNA核苷酸序列和编码区氨基酸序列图；图2为本专利技术中不同物种COMT氨基酸多序列比对结果图；图3为本专利技术中不同物种COMT氨基酸的系统进化树结果图；图4为本专利技术中PtCOMT在健康三疣梭子蟹不同组织的相对表达量结果图；图5为本专利技术中PtCOMT在健康三疣梭子蟹在不同幼体发育阶段的相对表达量结果图；图6为本专利技术中实时定量PCR分析注射多巴胺DA后的三疣梭子蟹肌肉中的PtCOMT表达变化的结果图(不同的字母表示DA注射组和对照组之间的显着差异(P<0.05))；图7为本专利技术中实时定量PCR分析注射多巴胺DA后的三疣梭子蟹神经节中的PtCOMT表达变化的结果图(不同的字母表示DA注射组和对照组之间的显着差异(P<0.05))；图8为本专利技术中Westernblot检测注射多巴胺DA后三疣梭子蟹肌肉中的PtCOMT蛋白的表达量变化结果图(不同的字母表示DA注射组和对照组之间的显着差异(P<0.05))；图9为本专利技术中Westernblot检测注射多巴胺DA后三疣梭子蟹神经节中的PtCOMT蛋白的表达量变化结果图(不同的字母表示DA注射组和对照组之间的显着差异(P<0.05))；图10为本专利技术中注射多巴胺实验组和对照组三疣梭子蟹通过池中间的频率统计。具体实施方式以下通过结合附图、序列表及实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本专利技术中的三疣梭子蟹Crustin的cDNA序列克隆及体外本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三疣梭子蟹COMT基因，其特征在于：所述三疣梭子蟹COMT基因的序列如SEQ NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种三疣梭子蟹COMT基因，其特征在于：所述三疣梭子蟹COMT基因的序列如SEQNO.1所示。2.根据权利要求1所述的三疣梭子蟹COMT基因，其特征在于所述的三疣梭子蟹COMT基因的氨基酸序列为：MetAlaThrThrValLysSerTyrSerSerGluAspProLeuLeuLysTyrThrValAspHisSerLeuArgLeuThrAspValGlnLysArgLeuAsnGluValThrPheLysHisSerArgTyrGlnMetLeuGlyAlaProGluValLeuGlnLeuAsnAlaAsnLeuIleGlnAlaIleGlyGlyLysLysValLeuAspValGlyValPheThrGlyAlaSerSerLeuSerAlaAlaLeuAlaLeuProProAspGlyGluValHisAlaLeuAspIleThrGluGluTyrProSerIleGlyLysProPheTrpAlaGluAlaGlyValAlaAspLysIleHisLeuHisIleAlaProAlaGlyGlnThrLeuGlnArgLeuIleAspGluGlyHisAlaGlySerPheAspPheAlaPheIleAspAlaAspLysProGly...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘磊，朱芳，付媛媛，王春琳，母昌考，李荣华，宋微微，史策，叶央芳，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33