本发明专利技术的目的是提供一种LAS1基因在皂苷高产型海参选育中的应用，通过高效检测LAS1基因关键催化位点，以实现皂苷高产型海参的选育。本发明专利技术首先提供仿刺参LAS1基因，该基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其一种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，上述刺参LAS1基因中的10个皂苷合成的关键催化位点，包含有LAS1蛋白氨基酸序列的第4位(L)、第5位(R)、87位(P)、104位(L)、214位(L)、249位(L)、434位(W)、441位(H)和531位(S)、648位(S)；本发明专利技术所提供的10个皂苷合成的关键催化位点可用在皂苷高产型刺参的选育中。
【技术实现步骤摘要】
LAS1基因在皂苷高产型海参选育中的应用
本专利技术属于遗传育种
，具体涉及LAS1基因在皂苷高产型海参选育中的应用。
技术介绍
海参作为海产八珍之一，具有重要的营养价值和药用价值，素有“陆有人参，海有海参”之说。全世界海参有1200多种，中国海域约有140多种，其中仿刺参是我国目前产量最高、最重要的海参养殖种类。早在400年前的明代，《食物本草》中就记录海参具有主补元气、滋益五脏六腑虚损的养生功能。清代《本草纲目拾遗》将海参列为补益药物，有“海参性温补，足敌人参，故名海参”，“补肾经，益精髓，消痰涎，摄小便，生血壮阳，治疗溃疡生殖”的记载。海参中含有丰富的海参皂苷，是其药用价值的主要组分。近些年国内外研究显示，海参皂苷具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗菌等多种重要生物活性，因而在食品、医药等方面具有重要的开发价值和应用前景。类固醇是广泛分布于生物界的一大类环戊稠全氢化菲衍生物。其中胆固醇是人体的必需组成成分，是构成细胞膜的重要组成成分，也是合成多种激素和微生物的前体物质。大多数动物都能够从头合成胆固醇，但仅有少数动物如海参等具有合成皂苷的能力。近些年国内外研究显示，海参皂苷具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗菌等多种重要的生物活性，因而在食品、医药等方面具有重要的开发价值和应用前景。皂苷作为一类重要的次生代谢产物，其合成广泛存在于植物界中。在植物中，三萜类皂苷通过三萜类合成途径合成(如人参中，通过β-香树脂醇合酶催化，将2,3氧化鲨烯转成β-香树脂醇)，而动物中并不存在此合成通路，仅存在与此途径相类似的胆固醇合成途径(即通过羊毛甾醇合酶LAS催化，将2,3氧化鲨烯转换成羊毛甾醇)。专利技术人前期研究发现，仿刺参基因组中不具有完备的胆固醇合成通路基因，因而不能从头合成胆固醇，其通过改造脊椎动物的经典胆固醇合成途径而具备了合成皂苷的能力。体外酵母实验证实，海参LAS1基因的催化产物正是海参皂苷的合成前体--帕克醇。动物胆固醇合成途径中的关键基因LAS(羊毛固醇合酶)在仿刺参中通过快速趋同进化获得植物类型的位点，从而使其实现从胆固醇合成转换至皂苷合成。鉴于海参皂苷在食品、医药等方面具有的重要开发价值和应用前景，因此，通过检测LAS1基因关键催化位点来筛选皂苷高产型海参就具有重要应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种LAS1基因在皂苷高产型海参选育中的应用，通过高效检测LAS1基因关键催化位点，以实现皂苷高产型海参的选育。本专利技术首先提供仿刺参LAS1基因，该基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO:1，其一种编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2，上述刺参LAS1基因中的10个皂苷合成的关键催化位点，包含有LAS1蛋白氨基酸序列的第4位(L)、第5位(R)、87位(P)、104位(L)、214位(L)、249位(L)、434位(W)、441位(H)和531位(S)、648位(S)；本专利技术所提供的10个皂苷合成的关键催化位点可用在皂苷高产型刺参的选育中；本专利技术再一个方面提供一种筛选皂苷高产型刺参的方法，是通过检测上述10个皂苷合成的关键催化位点的数目来实现的；其一种具体的操作方法是根据获得的仿刺参LAS1基因的cDNA序列设计扩增引物，提取仿刺参管足组织的总RNA，反转录为cDNA作为模板进行扩增，将获得的PCR引物进行测序，计算不同个体LAS1基因含有的植物型位点的比例。通过筛选含高比例植物型位点的个体(即皂苷高产型的个体)，从而实现仿刺参的皂苷高产型良种选育。其中引物的一种具体序列信息如下：正向引物：5'-AGCTATGCCTGGGCTGAG-3'(SEQIDNO:3)、反向引物：5'-GGTTATACATGGGGGATCTTTTC-3'(SEQIDNO:4)。具体实施方式申请人筛选获得了影响海参皂苷合成的10个关键的植物型位点，再根据获得的仿刺参LAS1基因的cDNA序列设计扩增引物，提取仿刺参管足组织的总RNA，反转录为cDNA作为模板进行扩增，将获得的PCR引物进行Sanger测序，计算不同个体LAS1基因含有的植物型位点的比例。通过筛选含高比例植物型位点的个体(即皂苷高产型的个体)，从而实现仿刺参的皂苷高产型良种选育。下面通过实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1影响海参皂苷合成的10个关键的植物型位点的筛选及验证本专利技术中皂苷高产型仿刺参的遗传筛选包括以下步骤：a)LAS1基因植物型位点的筛查；b)仿刺参管足总RNA的提取；c)cDNA第一链的合成；d)LAS1基因10个植物型位点的检测及比例计算。具体操作如下：a)LAS1基因植物型位点的筛查。在NCBI数据库下载16种植物的CAS或CPQ和BAS的蛋白编码序列，包括绿玉树，白桦树，人参，豌豆，苜蓿，甘草，燕麦，积雪草，拟南芥，百脉根，油橄榄，西洋蒲公英，丝瓜，蓖麻和西葫芦；下载12种动物的LAS序列，包括海绵，海蠕虫，海豆芽，帽贝，囊舌虫，海星，海胆，文昌鱼，果蝇，鸡，小鼠和人。将这些序列利用MEGA7.0软件进行ClustalW比对，统计每个位置植物CAS(CPQ)、BAS与动物LAS基因中氨基酸残基的百分比，定义海参LAS1基因中在动物类群LAS基因中出现的频率低于20％，而在植物BAS基因或植物CAS基因中出现的频率高于55％的位点为植物型位点。与LAS1酶活性位点联合分析，最终确定以下10个氨基酸位点是催化仿刺参帕克醇合成的关键位点：第4位(L)、第5位(R)、87位(P)、104位(L)、214位(L)、249位(L)、434位(W)、441位(H)和531位(S)、648位(S)b)从市场采买100头仿刺参并进行总RNA的提取。按照Trizol方法从仿刺参管足中提取总RNA。c)cDNA第一链的合成。以2μg总RNA为模板，分别加入1μl20μMOligod(T)18，RNase&DNase-freeH2O补足至13μl，混匀离心。70℃保温10min，立即置于冰上，以打开RNA二级结构。依次加入：5μl5×M-MLVBuffer，5μldNTP(2.5mM)，1μlRNasin(40U/μl)，1μlM-MLV(200U/μl)；混匀离心后，42℃，90min。94℃，5min，以灭活反转录酶。分装后-20℃保存。d)LAS1基因10个植物型位点的检测及比例计算。用PrimerPremier5.0分别设计LAS1基因功能域区段的引物(正向：5'-AGCTATGCCTGGGCTGAG-3'和反向：5'-GGTTATACATGGGGGATCTTTTC-3')，以上述得到的一链cDNA为模板进行PCR扩增(扩增体系：2μlcDNA,引物1和2各1μl，10×buffer1μl，dNTP0.8μl，Taq酶0.1μl，H2O4.1μl)。扩增产物与PMDT8-T载体进行16℃连接6小时(连接体系为PCR产物4.5μl，SolutionI5μl，PMD18-Tvector0.5μl)，将连接产物进行大肠杆菌转化：①准备工作：将感受态细胞(DH5α)放置冰上化约20min，调金属浴42℃，将大中小枪头各一盒，1.5mlEP管紫外灯下灭菌15min；②在超净工作台上操作，将感受态细胞平均分到3个1.5mlEP管中，用中枪轻轻搅拌吹吸本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种刺参LAS1基因，其特征在于，所述的基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
【技术特征摘要】
1.一种刺参LAS1基因，其特征在于，所述的基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO:1。2.如权利要求1所述的LAS1基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2。3.权利要求1所述的LAS1基因中的与皂苷合成的关键催化位点，其特征在于，所述的关键催化位点包含有氨基酸序列为SEQIDNO:1的LAS1蛋白氨基酸序列的第4位、第5位、87位、104位、214位、249位、434位、441位、531位和648位。4.权利要求4所述的关键催化位点在皂苷高产型刺参的选育中...
【专利技术属性】
技术研发人员：包振民，李语丽，王师，刘雅然，陆维，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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