抑制β淀粉样蛋白聚集的碱化溶菌酶及制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种抑制β淀粉样蛋白聚集的碱化溶菌酶及制备方法和应用，溶菌酶分子表面的羧基上平均修饰数目介于0.5‑7个乙二胺分子。向0.1mol/L的2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸缓冲液中加入乙二胺液体，用浓盐酸调节pH4.5～7.5，加入溶菌酶固体溶解，并加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐，搅拌反应；除去游离乙二胺和EDC，得到分子结构稳定的碱化溶菌酶。通过在溶菌酶表面进行化学改性，合成碱化溶菌酶，有效增加溶菌酶表面的正电荷，反应温和简便。碱化溶菌酶能够有效抑制Aβ42的聚集，改变Aβ42聚集体的形貌，阻止并减缓向纤维状形貌的转化。作为治疗阿尔茨海默氏症的药物的应用有广阔的前景。

【技术实现步骤摘要】
抑制β淀粉样蛋白聚集的碱化溶菌酶及制备方法和应用
本专利技术涉及一种抑制β淀粉样蛋白聚集的碱化溶菌酶及制备方法和应用，属于生物医药

技术介绍
阿尔茨海默氏症(Alzheimer’sdisease,AD)是老年痴呆症的最主要发病形式，截止2016年全球已有超过4700万名AD患者，到2050年这一数字预计将达到1亿3100万(WorldAlzheimerreport2016)。AD的病理学特征是神经细胞内神经纤维扭结以及细胞外的老年斑沉积(Nature,2014,515:274-278)。老年斑的主要成分是β淀粉样蛋白(amyloidβ-peptide,Aβ)。Aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid-βprecursorprotein，APP)经β和γ分泌酶依次切割而成包含39-43个氨基酸残基的多肽(Langmuir,2012,28:6595-6605)。Aβ的两种主要类型分别是Aβ40和Aβ42，其中Aβ40含量较为丰富，Aβ42毒性更强(Science,2006,314:777-781)。研究表明，Aβ的聚集依照核依赖生长过程，Aβ首先形成具有规则结构的核，然后溶液中的寡聚体就会与核相结合并进一步生长为原纤维、纤维(Journalofmolecularbiology,2012,422:723-730)。构象上，天然的单体Aβ表现为无规则卷曲结构，而发生聚集时，Aβ构象会逐渐转变为β-sheet结构，这种具有β-sheet构象的Aβ更利于淀粉样聚集体的形成。基于淀粉样假说，Aβ淀粉样聚集及其产生的神经毒性是导致AD病理学特征的主要原因，因此抑制Aβ的淀粉样聚集是治疗AD的可行性手段，能够阻止或延迟AD的发病(Currentopinioninstructuralbiology,2003,13:526-532)。目前，已报道的Aβ抑制剂种类包括小分子类、多肽类、纳米粒子类和蛋白类。小分子抑制剂结构简单、易于获得，但多数小分子抑制剂存在溶解性差、体内半周期较短、稳定性较差和生物利用度低等缺陷(JournalofBiologicalChemistry,2007,282:10311-10324)。多肽抑制剂大多为Aβ的疏水区段及其衍生肽，虽然多肽抑制剂具有生物相容性好、分子量小等优点，但其抑制效果一般且具有自聚倾向，体内稳定性差，易被蛋白酶水解等严重缺陷(ACSChemicalNeuroscience,2010,1:661-678)。近年，纳米粒子因其具有合成简单、易于功能化、具有较大的比表面积等特点，在Aβ聚集抑制剂的开发中显示出很大优势，然而一些纳米颗粒抑制剂存在生物相容性较差、抑制效果一般等缺陷(ChemicalScience,2012,3:868-873)。与上述抑制剂相比，蛋白类抑制剂由于其具有生物相容性好、便于化学改性等优点，越来越受到重视。人溶菌酶(humanlysozyme,hLys)是一种重要的天然非特异性免疫蛋白，广泛存在于体液和组织中(Scientificreports,2016,6:22947)。在AD患者脑内，hLys被发现与Aβ一起共存于淀粉样斑块中(Neurobiologyofdisease,2015,83:122-133)。亦有研究报道，hLys能有效地抑制Aβ1-40、Aβ1-42和Aβ17-42的聚集和毒性(ChemicalCommunications,2013,49:6507-6509；Neurobiologyofdisease,2015,83:122-133；PloSone,2014,9:113041)。但是，hLys的抑制效果仍然有限。因此，如何提高hLys抑制Aβ聚集的能力成为了开发AD治疗候选药物的一个重要技术问题。研究表明，生理条件下Aβ带负电，其与溶菌酶的相互作用以静电相互作用和疏水相互作用为主(ChemicalCommunications,2013,49:6507-6509)。因此，本专利技术提出一种通过hLys表面化学改性，在消除负电荷的同时引入正电荷，在生理条件下获得的碱化溶菌酶与Aβ间的静电相互作用更强，由此更加有效地抑制Aβ的聚集。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有抑制β-淀粉样蛋白聚集功能的碱化溶菌酶抑制剂和制备方法及其在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的应用。所述的碱化溶菌酶抑制剂不仅结构性质稳定、生物相容性好而且对Aβ聚集及毒性具有良好的抑制效果。本专利技术是通过下述技术方案加以实现的，一种碱化溶菌酶，其特征在于溶菌酶分子表面的羧基上平均修饰数目介于0.5-7个乙二胺分子。碱化溶菌酶结构如下：黑球表示溶菌酶分子。上述的具有抑制β-淀粉样蛋白聚集功能的一种碱化溶菌酶制备方法，向0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液中加入乙二胺液体，然后用浓盐酸调节pH4.5～7.5，随后加入溶菌酶固体使其溶解，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，搅拌反应；除去游离乙二胺和EDC，得到分子结构稳定的碱化溶菌酶(basifiedhumanlysozyme,B-hLys)。优选加入溶菌酶固体的浓度为1～20mg/mL。优选2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中加入的乙二胺与溶菌酶的摩尔比(即乙二胺加入量)范围为5～400:1。优选加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为1～20mg/mL。优选搅拌反应条件是在25℃～50℃条件下搅拌反应0.5～24h。本专利技术的反应式如下：本专利技术合成一种碱化溶菌酶，利用质谱测得平均分子量，计算得到在溶菌酶表面修饰了0.5-7个乙二胺分子，通过实验测试反应前后溶菌酶的ζ电势，结果表明该反应可以有效增加生理条件下溶菌酶表面的正电荷，粒径和内源荧光实验表明改性后的碱化溶菌酶保持了天然溶菌酶的结构和稳定性。本专利技术合成的碱化溶菌酶，增强了其与Aβ的相互作用，相比于单独培养的Aβ，0.5倍摩尔量的碱化溶菌酶将其ThT荧光值从100％降至19.0％，将Aβ聚集体产生的细胞毒性从37.5％降至8.6％。原子力显微镜(AFM)观察结果表明，与碱化溶菌酶共培养的Aβ形态从长的纤维状聚集体转换成小的不定形聚集体。因此，这种碱化溶菌酶可以有效抑制Aβ的聚集和降低Aβ聚集体对细胞产生的毒性。本专利技术所述的碱化溶菌酶在抑制和预防β-淀粉样蛋白聚集中的应用，有效量的碱化溶菌酶可达到抑制Aβ聚集和降低Aβ聚集体的细胞毒性的效果，因此用于治疗β-淀粉样蛋白聚集相关的疾病药物。本专利技术所述的碱化溶菌酶在蛋白质药物中的应用，该蛋白质药物可用于预防、治疗和延缓阿尔兹海默病等疾病。本专利技术提供的一种具有抑制β-淀粉样蛋白聚集功能的碱化溶菌酶新型抑制剂及制备方法和其在抑制β-淀粉样蛋白聚集中的应用，具有如下的优势：第一，通过在溶菌酶表面进行化学改性，合成碱化溶菌酶，可以有效增加溶菌酶表面的正电荷，反应温和简便。第二，碱化溶菌酶能够有效抑制Aβ42的聚集，其改变了Aβ42聚集体的形貌，阻止并减缓了其向纤维状形貌的转化。第三，碱化溶菌酶有效降低了Aβ42聚集体对细胞产生的毒性，是Aβ42聚集的理想抑制剂。作为制备治疗阿尔茨海默氏症的药物的应用有广阔的前景。附图说明图1：实施例1中同浓度溶菌酶和低修饰密度的碱化溶菌酶(B本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制β淀粉样蛋白聚集的碱化溶菌酶，其特征在于溶菌酶分子表面的羧基上平均修饰数目介于0.5‑7个乙二胺分子；碱化溶菌酶结构如下：

【技术特征摘要】
1.一种抑制β淀粉样蛋白聚集的碱化溶菌酶，其特征在于溶菌酶分子表面的羧基上平均修饰数目介于0.5-7个乙二胺分子；碱化溶菌酶结构如下：2.权利要求1的抑制β淀粉样蛋白聚集的碱化溶菌酶的制备方法，其特征是：向0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液中加入乙二胺液体，然后用浓盐酸调节pH4.5～7.5，随后加入溶菌酶固体使其溶解，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，搅拌反应；除去游离乙二胺和EDC，得到分子结构稳定的碱化溶菌酶。3.如权利要求2所述的方法，其特征是溶菌酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙彦，李茜，史清洪，董晓燕，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12