本发明专利技术公开了一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体NJ‑P3，分类命名为Podoviridae phage，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2018099。本发明专利技术还公开了所述的噬菌体NJ‑P3在防治番茄土传青枯病的用途和在制备防治番茄土传青枯病噬菌体制剂的用途。本发明专利技术噬菌体能够特异性裂解青枯病病原菌，在温度20～40℃、pH＝5～9范围内噬菌体活性最高，裂解能力最强，均表现出杀菌能力，室内抑菌试验显示其抑菌率达到了72.4％，可用于番茄土传青枯病的防治。将本发明专利技术噬菌体用于防治番茄图传青枯病，盆栽防病率达到60％，大田生防率可达85.19％。
【技术实现步骤摘要】
一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体及其用途
本专利技术属于番茄青枯病的防控领域，涉及一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体NJ-P3及其用途。
技术介绍
番茄青枯病是由茄科劳尔氏菌Ralstoniasolanacearum(简称青枯菌)引起的一种毁灭性土传细菌病害，严重制约着我国番茄产业的发展。青枯菌通过植物根尖伸长区细胞或次生根生长点的伤口处进入番茄根部，由维管束向地上部分迁移使植株萎蔫，直至死亡。由于青枯菌在环境中有较强的变异性，侵染不同植物的种型不同，产生不同的青枯专化型，加之青枯菌传播途径复杂，寄主范围较广，从而造成了防治上的困难。目前，主要从物理防治、化学防治、生物防治三个方面来防控病害，虽然在一定程度上能够减少青枯病引起的损失，但都无法从根本上有效控制该病的发生。由于各种耐药性病原菌不断出现，筛选高效防控青枯病的细菌越来越困难，寻找一种安全有效的方法迫在眉睫。噬菌体作为一种病毒，主要以细菌为宿主，在自然界中普遍存在。噬菌体侵入会导致细菌细胞的裂解，破坏细菌的新陈代谢，并导致细菌自毁，通过噬菌体裂解细菌治疗病原菌感染的治疗手段称为噬菌体疗法。噬菌体还具有特异性、高效性等其他抗菌剂无法比拟的优点，逐渐成为新型药物开发的研究热点之一。通过国内外医学家的不懈努力，噬菌体在医学上发挥了重要作用，然而，对于噬菌体防控土传病害方面研究比较单一，大多数局限于研究烟草青枯病防治，对于防控番茄青枯病方面的研究尚少，因此，用噬菌体裂解病原菌来防控番茄青枯病害具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体NJ-P3，分析其各项生物学特性，探讨其对番茄青枯病的防治效果，利用病原菌特异性噬菌体对番茄青枯病进行生物防治，高效裂解细菌使其死亡，且对环境没有毒性；特异性强，不会破坏其他正常菌群，可保持土壤微生物平衡。本专利技术的另一目的在于提供一种新型、高效的抗番茄青枯病噬菌体制剂。本专利技术的另一目的在于提供利用该噬菌体防治番茄青枯菌的用途。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一株茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanancearum)专性噬菌体NJ-P3，分类命名为Podoviridaephage，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:M2018099。该茄科劳尔氏菌专性噬菌体NJ-P3分离自青枯病发病严重的根际土壤中，为有尾噬菌体目短尾噬菌体科。该茄科劳尔氏菌专性噬菌体NJ-P3在防治番茄土传青枯病或制备防治番茄土传青枯病噬菌体制剂的应用。一种防治土传青枯病的噬菌体制剂，该噬菌体制剂中包含上述的茄科劳尔氏菌专性噬菌体NJ-P3。作为进一步优选技术方案，该噬菌体制剂中噬菌体NJ-P3的含量≥108PFU/mL。所述的噬菌体制剂的制备方法，包括：取本专利技术噬菌体溶液按照感染复数接入到对数生长期的青枯菌R.solanacearum菌液中，混匀，置于20～40℃、优选为30℃，170r/min摇床中振荡培养10h～24h使噬菌体增殖，将增殖培养后的共培养悬液离心，取上清液经0.22μm滤膜过滤，过滤得到噬菌体悬液，无菌水调节噬菌体浓度，得到噬菌体制剂。所述的对数生长期的青枯菌R.solanacearum菌液中青枯菌的浓度为108CFU/mL。所述的青枯菌R.solanacearum菌液为QL-Rs1115菌液，通过以下方法制得：青枯菌QL-Rs1115菌液在SMSA选择性培养基上划线活化，30℃恒温培养箱中培养48h；挑取SMSA平板上形成的单菌落转接到50mLNA液体培养基中，30℃、170r/min摇床中培养24h，获得对数生长期的QL-Rs1115菌液。所述的感染复数为0.01～0.1，优选为最佳感染复数0.1。所述的共培养液12000r/min高速离心5min。上述的噬菌体制剂在防治番茄土传青枯病的应用中效果显著。一种防治番茄土传青枯病的方法，噬菌体制剂直接以灌根的方式接种到番茄植株根际，噬菌体的添加量为≥5×108PFU/株，优选为5×108PFU/株。本专利技术的有益效果：本专利技术的噬菌体能够特异性裂解青枯病病原菌，在温度20℃～40℃、pH＝5～9范围内噬菌体活性最高，裂解能力最强，均表现出较强的杀菌能力，室内抑菌试验显示其抑菌率达到了72.4％，可用于番茄土传青枯病的防治。将本专利技术噬菌体用于防治番茄土传青枯病，盆栽防病率达到60％，大田生防率可达85.19％，从根本上有效控制该病的发生。附图说明图1为噬菌体在双层平板上形成的噬菌斑；其中，6、7、8、9分别表示将噬菌体悬浮液用无菌水梯度稀释到106、107、108、109。图2为噬菌体NJ-P3在电镜下的形态。图3为噬菌体NJ-P3的系统发育树。图4为噬菌体NJ-P3一步生长曲线。图5为噬菌体NJ-P3对温度的耐受能力。图6为噬菌体NJ-P3对酸碱的耐受能力。图7为噬菌体NJ-P3的抑菌性能。生物保藏信息：噬菌体NJ-P3，分类命名为Podoviridaephage，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:M2018099。具体实施方式实施例1青枯菌专性噬菌体的筛选在江苏省南京市麒麟镇后村番茄大棚中青枯病发病区域采集得到番茄植株根际土壤样品，通过双层平板法筛选出一株具有高效裂解能力的青枯菌专性噬菌体NJ-P3。1.1配制所需培养基：NA液体培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、酵母粉0.5g、去离子水1000mL，pH7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。NA半固体培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、酵母粉0.5g、10g琼脂粉、去离子水1000mL，pH7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。NA固体培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、牛肉浸膏3g、酵母粉0.5g、20g琼脂粉、去离子水1000mL，pH7.2～7.4，115℃高压灭菌30min。青枯菌选择性培养基(SMSA选择性培养基)：在1000mLNA固体培养基中依次加入TTC50mg、结晶紫50mg、多粘菌素100mg、杆菌肽20mg、氯霉素5mg、放线菌酮50mg、青霉素5mg。SM缓冲液：MgSO4·7H2O2.0g，NaCl5.8g，1mol/LTris-HCl(pH7.5)50mL，2％明胶5mL，加去离子水，定容至1000mL，分装后于121℃高压灭菌20min，4℃保存。SM缓冲液用于噬菌体的稀释及保存。1.2青枯菌QL-Rs1115菌液制备将-80℃超低温冰箱中保存的青枯菌QL-Rs1115[1](从江苏省南京市麒麟镇发病区的番茄植株根际中分离获得的具有强致病力的青枯菌)菌液在SMSA选择性培养基上划线活化，30℃恒温培养箱中培养48h。挑取单菌落转接到50mLNA液体培养基中，在30℃、170r/min摇床中培养24h，获得对数生长期的QL-Rs1115菌液，备用。1.3青枯菌专性噬菌体的分离纯化称取采集的番茄植株根际土壤样品10g于已灭菌三角瓶中，加入90mL无菌水混匀，放置于30℃、170r/min摇床中振荡培养12h，取出后静置2h。将富集好的土壤悬浮液转装到已灭菌的2mL离心管中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体NJ‑P3，分类命名为Podoviridae phage，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2018099。
【技术特征摘要】
1.一株具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体NJ-P3，分类命名为Podoviridaephage，于2018年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2018099。2.权利要求1所述的噬菌体NJ-P3在防治番茄土传青枯病的用途。3.权利要求1所述的噬菌体NJ-P3在制备防治番茄土传青枯病噬菌体制剂的用途。4.一种防治土传青枯病的噬菌体制剂，其特征在于噬菌体制剂中包含权利要求1所述的具有防控番茄青枯病的裂解性噬菌体NJ-P3。5.根据权利要求4所述的防治土传青枯病的噬菌体制剂，其特征在于噬菌体制剂中噬菌体NJ-P3的含量≥108PFU/mL。6.权利要求4或5所述的防治土传青枯病的噬菌体制剂的制备方法，其特征在于包括：噬菌体按照感染复数接入到对数生长期的青枯菌R.solan...
【专利技术属性】
技术研发人员：韦中，侯玉刚，王孝芳，徐阳春，沈其荣，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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