高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用。所述工程菌为大肠杆菌或地芽孢杆菌，并携带有表达地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体。利用高温产核黄素的大肠杆菌工程菌生产核黄素，发酵液中核黄素产量最高可达276mg/L左右，利用高温产核黄素的地芽孢杆菌工程菌生产核黄素，产量最高可达50mg/L左右。本发明专利技术提供的工程菌比现有的核黄素工程菌生产周期短，节约能源，可以低成本地用于核黄素的生产，为高温条件下生产核黄素提供宝贵的菌种资源。

【技术实现步骤摘要】
高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及基因工程和发酵工程
，具体地说，涉及高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
核黄素，即维生素B2(Riboflavin)，是细菌和动物必需的维生素之一，在生物体内通常以FMN和FAD的形式存在，参与细胞内氧化还原反应。它主要应用在制药，饲料添加剂，食品添加剂和化妆品，目前，核黄素生产工艺是微生物发酵法。在早期其生产菌株为真菌，像解朊假丝酵母(Candidafamata)、棉囊阿舒氏酵母(Ashbyagossypii)、阿舒氏假囊酵母(Eremotheciumashbyii)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等(Stahmannetal,2016,ApplMicrobiolBiotechnol100:2107-2119)。但由于真菌生产核黄素存在着一些问题，例如发酵周期长(6-7天)、产量较低(小于5g/L)、原料成分配比复杂、菌体粘度大、后期分离困难、需加入不饱和脂肪酸来促进核黄素合成等。随后，又开发了以细菌为宿主菌的基因工程菌。这些基因工程菌具有发酵周期短(2-3天)、原料要求简单、产量高、成熟的原核细胞基因工程技术等优点，迅速替代了利用真菌的生产技术。目前，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)通过遗传改造成为主要的核黄素工业生产菌，但其生产过程属于常温发酵，能耗高。主要体现在生产过程中需维持常温，以缓解发酵过程的生物热。与之相比，高温发酵(45～60℃)更具有优势。对于细菌个体，在较高温度下，细胞内酶的反应速率提高，细胞生长快。对于工业生产，高温发酵缩短了发酵周期，一是细菌生长快，可在较短时间内达到产目的代谢物的生产状态；二是设备原料等高温灭菌冷却时间较少，节能节水。同时，高温发酵节约生产成本，在生产过程的冷却水维持恒定温度是必不可少的，且常温发酵过程中冷却水的耗费约占生产成本的20％，而高温发酵可以减少甚至不使用冷却水。此外，高温发酵可以避免常温杂菌的污染，减少原料的浪费。因此，开发核黄素高温生产工艺是未来核黄素工业发展的方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供高温产核黄素的工程菌及其构建方法与应用，特别是高温产核黄素的地芽孢杆菌和大肠杆菌工程菌的构建及应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的高温产核黄素的工程菌，其为大肠杆菌或地芽孢杆菌，并携带有表达地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体。优选地，所述大肠杆菌的出发菌株为JM109、EK-12MG1655或BL21(优选JM109)，所述地芽孢杆菌的出发菌株为热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB11955。优选地，所述地芽孢杆菌核黄素合成基因簇来自于热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB11955或热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)CGMCC1.5331，用于扩增热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌核黄素合成基因簇tgrib的引物序列如SEQIDNO:1-2所示，用于扩增热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇dnrib的引物序列如SEQIDNO:3-4所示。优选地，所述地芽孢杆菌核黄素合成基因簇是通过表达载体pUCG3.8导入宿主菌的。质粒pUCG3.8可参见JeremyBartosiak-Jentysetal,ModularsystemforassessmentofglycosylhydrolasesecretioninGeobacillusthermoglucosidasius，Microbiology(2013),159,1267–1275。其他大肠杆菌地芽孢杆菌穿梭载体也可用于本专利技术。所述高温产核黄素的工程菌可按如下方法构建得到：1、重组质粒的构建(图1)：(1)以质粒pTAC-RiboJ-gfp为模板，用引物sgfps和sgfpa进行PCR扩增，获得sgfp和终止子T3序列；以热脱氮地芽孢杆菌基因组为模板，用引物Pldhs和Pldha进行PCR扩增，获得启动子pLdh序列；然后经过融合PCR，得到pLdh-sgfp-T3序列；将pUCG3.8和pLdh-sgfp-T3进行EcoRI和BamHI双酶切，然后T4连接酶连接，经转化，卡那霉素抗性筛选，获得重组质粒pUCG3.8S；(2)以pUCG3.8S为模板，用引物pucG3.8ls和pucG3.8la进行PCR扩增，获得含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列；(3)以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB11955基因组为模板，用引物Tgribs和Tgriba扩增得到核黄素合成基因簇tgrib；再以热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)CGMCC1.5331基因组为模板，用引物Dnribs和Dnriba扩增得到核黄素合成基因簇dnrib；(4)将上述步骤(2)含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列分别与步骤(3)的核黄素合成基因簇tgrib和dnrib进行Gibson组装，转化JM109，筛选得到重组质粒pUCG3.8-R1和pUCG3.8-R2。质粒Ptac-RiboJ-gfp可参见ChunboLouetal,Ribozyme-basedinsulatorpartsbuffersyntheticcircuitsfromgeneticcontext,Naturebiotechnology(2012),30,P1137–1142。2、工程菌的构建：将上述重组质粒pUCG3.8-R1或pUCG3.8-R2转入大肠杆菌(EscherichiacoliJM109)或地芽孢杆菌(GeobacillusthermoglucosidasiusNCIMB11955)，从而获得高温产核黄素的工程菌。其中，步骤2)中使用的引物序列见表1：表1本专利技术还提供所述工程菌在发酵生产核黄素中的应用。前述的应用，所述工程菌为大肠杆菌，将菌种接入含有抗生素的LBG培养基中，在≤45℃(37℃～45℃)条件下发酵生产核黄素。本专利技术中，所述LBG培养基为含有10g/L葡萄糖和20.9g/L3-(N-玛琳代)丙磺酸(MOPS)的LB液体培养基。优选地，将菌种接入含有7.5-12.5μg/mL卡那霉素的LBG培养基中，250mL摇瓶的装液量为50mL，在≤45℃(37℃～45℃)，摇床转速220-250r/min条件下发酵生产核黄素。更优选地，所述LBG培养基中还添加有1％CaCO3，以维持培养液的pH值在菌株生长范围。以含有热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的大肠杆菌作为生产菌株，摇瓶发酵生产核黄素，在如下发酵条件下，核黄素产量达到最大，为276mg/L左右。具体发酵条件为：以接种后OD600值为0.1的接种量将种子液接入不含有CaCO3的LBG培养基中，摇瓶装液量50mL/250mL，发酵培养基中卡那霉素浓度7.5μg/mL；发酵温度45℃，摇床转速250r/min，发酵48小时至OD600值4.8左右(发酵结束后发酵液pH值约为5.3)。以含有热脱氮地芽孢杆菌核黄素合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高温产核黄素的工程菌，其特征在于，其为大肠杆菌或地芽孢杆菌，并携带有表达地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体。

【技术特征摘要】
1.高温产核黄素的工程菌，其特征在于，其为大肠杆菌或地芽孢杆菌，并携带有表达地芽孢杆菌核黄素合成基因簇的表达载体。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌的出发菌株为JM109、EK-12MG1655或BL21，所述地芽孢杆菌的出发菌株为热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB11955。3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述地芽孢杆菌核黄素合成基因簇来自于热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB11955或热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)CGMCC1.5331，用于扩增热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌核黄素合成基因簇tgrib的引物序列如SEQIDNO:1-2所示，用于扩增热脱氮地芽孢杆菌核黄素合成基因簇dnrib的引物序列如SEQIDNO:3-4所示。4.根据权利要求1-3任一项所述的工程菌，其特征在于，所述表达载体为pUCG3.8或其他大肠杆菌地芽孢杆菌穿梭载体。5.权利要求1-4任一项所述工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以质粒pTAC-RiboJ-gfp为模板，用引物sgfps和sgfpa进行PCR扩增，获得sgfp和终止子T3序列；以热脱氮地芽孢杆菌基因组为模板，用引物Pldhs和Pldha进行PCR扩增，获得启动子pLdh序列；然后经过融合PCR，得到pLdh-sgfp-T3序列；将pUCG3.8和pLdh-sgfp-T3进行EcoRI和BamHI双酶切，然后T4连接酶连接，经转化，卡那霉素抗性筛选，获得重组质粒pUCG3.8S；(2)以pUCG3.8S为模板，用引物pucG3.8ls和pucG3.8la进行PCR扩增，获得含有pLdh和T3终止子的载体骨架序列；(3)以热葡萄糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)NCIMB11955基因组为模板，用引物Tgribs和Tgriba扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：李子龙，齐凤仙，范可强，王为善，王俊阳，杨克迁，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，中国科学院大学，
类型：发明
国别省市：北京,11