一种鸡蛋清过敏原分离方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡蛋清过敏原分离方法，属于蛋白分离技术领域，其步骤包含：1）鸡蛋清处理液调pH和离心配制处理，2）层析柱制备，3）层析分离，4）蛋白纯度检测，5）、蛋白质的浓缩。本发明专利技术应用阳离子交换层析法，将鸡蛋清处理后上样，通过洗脱液pH值和盐浓度调整，使四种蛋白质依次洗脱下来，经蛋白纯度检测验证，BCA法检测后计算卵白蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白和溶菌酶的提取率分别为60.0%、52.1%、29.6%和90.2%。

A method for separating allergens from egg white

The invention discloses an egg white allergen separation method, which belongs to the technical field of protein separation. The steps include: 1) adjusting pH of egg white treatment solution and centrifugal preparation, 2) chromatographic column preparation, 3) chromatographic separation, 4) protein purity detection, 5) protein concentration. The present invention uses cation exchange chromatography to treat egg white and sample it on, and through adjusting pH value and salt concentration of eluent, the four kinds of proteins are eluted successively. The purity of protein is tested and verified by BCA method, and the extraction rates of ovalbumin, ovalbumin, ovalbumin and lysozyme are 60.0% and 52.1% respectively. 29.6% and 90.2%.

【技术实现步骤摘要】
一种鸡蛋清过敏原分离方法
本专利技术涉及蛋白质分离
，具体为一种鸡蛋清过敏原分离方法。
技术介绍
鸡蛋中的过敏原主要存在于蛋清中，目前公认蛋清中的主要过敏原有4种，分别为卵白蛋白（45kDa），卵类粘蛋白(28kDa)，卵转铁蛋白(76kDa)和溶菌酶(14kDa)。过敏原标准品使用方便，然而已经证实很多标准品受到细菌内毒素(LPS)污染。LPS能够导致Th1/Th2类细胞因子失衡，因此在建立致敏动物模型或细胞实验时要严格控制过敏原中LPS的含量。分离纯化的过敏原可以不受LPS污染，是用于致敏模型的好选择。然而目前报道的分离纯化方法一次只能分离一种过敏原，不能同时对鸡蛋清中主要的四种过敏原进行分离。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述
技术介绍
困难，提供一种将鸡蛋清中四种主要过敏原进行分离的方法。为达到上述目的，采用的技术方案为：一种鸡蛋清过敏原分离方法，其步骤包含：1）、鸡蛋清处理液配制：新鲜鸡蛋去壳并分离出蛋清，冰浴中用玻璃棒缓慢搅拌至没有块状物质后，加入等体积蒸馏水并用1M盐酸调pH至6.0，4℃搅拌3h后，3000g离心10分钟；收集上清液，用1M盐酸调pH到3.8，4℃搅拌3h后再次离心，收集上清液于-20℃冻存备用；2）、层析柱制备：取GE公司的CM-sepharoseFF柱材，蒸馏水置换5-6次除去酒精，按常规装柱1.6cm×20cm，最终柱体积为30ml；3）、层析分离：用20mmol/L醋酸-醋酸钠pH4.0平衡柱子，至紫外监测仪读数稳定；上样5ml鸡蛋清处理液，控制流速在1.5ml/min，待穿过峰洗出后换上含0～0.2mol/LNaCl醋酸-醋酸钠pH4.3洗脱，200min后换成用含0.1～0.2mol/LNaCl醋酸-醋酸钠pH5.5洗脱；待315min时第4峰出峰结束，换上含0～0.4mol/LNaClPBS缓冲液pH7.4洗脱，直至出完最后两峰，分离结束；4）、蛋白纯度检测：将分离所得蛋白收集，取样10μl与10μl上样缓冲液混合后，取15μl加入聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE胶孔内，电泳后，凝胶经考马斯亮蓝显色进行检测；5）、蛋白质的浓缩：将收集到的四种蛋白质纯品用PEG浓缩，透析后冻干，于-20℃冻存。所述聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE为12%分离胶，5%浓缩胶。采用上述方案的有益效果为：这种鸡蛋清过敏原分离方法应用阳离子交换层析法，将鸡蛋清处理后上样，通过洗脱液pH值和盐浓度调整，使四种蛋白质依次洗脱下来，经蛋白纯度检测验证，BCA法检测后计算卵白蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白和溶菌酶的提取率分别为60.0%、52.1%、29.6%和90.2%。附图说明图1为本专利技术实施例中离子交换层析曲线示意图。图2为本专利技术实施例中过敏原蛋白SDS-PAGE的分离图。具体实施方式下面结合实施例进一步介绍本专利技术，但本专利技术不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。一种鸡蛋清过敏原分离方法，其步骤包含：1.鸡蛋清处理液的制备：新鲜鸡蛋去壳并分离出蛋清，冰浴中用玻璃棒缓慢搅拌至没有块状物质后，加入等体积蒸馏水并用1M盐酸调pH至6.0。4℃搅拌3h后，3000g离心10分钟。上清收集后用1M盐酸调pH到3.8，4℃搅拌3h后离心。上清液于-20℃冻存，即为鸡蛋清处理液。2.层析柱的制备：将GE公司的CM-sepharoseFF柱材取出适量，蒸馏水置换5-6次以除去酒精。按常规装柱(1.6cm×20cm)，最终柱体积约30ml。3.层析分离：用20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH4.0)平衡柱子，至紫外监测仪读数稳定。上样5ml鸡蛋清处理液。控制流速在1.5ml/min。待穿过峰洗出后换上含0～0.2mol/LNaCl醋酸-醋酸钠(pH4.3)洗脱，200min后换成用含0.1～0.2mol/LNaCl醋酸-醋酸钠(pH5.5)洗脱。待315min时第4峰出峰结束，换上含0～0.4mol/LNaClPBS缓冲液(pH7.4)洗脱，直至出完最后两峰，分离纯化结束。4.蛋白纯度检测：将分离所得蛋白收集，取样10μl与10μl上样缓冲液混合后，取15μl加入聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)胶孔内(15%分离胶，5%浓缩胶)，电泳后，凝胶经考马斯亮蓝显色。5.蛋白质的浓缩：将收集到的四种蛋白质纯品（卵转铁蛋白的前一个峰纯度不高，只收集第二个峰）用PEG浓缩，透析后冻干。于-20℃冻存。6.提取率计算：用BCA法测定蛋清处理液中以及四种分离纯化蛋白的蛋白质含量，查阅文献，蛋清中卵白蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白和溶菌酶的质量分数分别为54%、12%、11%和3.4%，再结合上样体积和收集的蛋白液体积，计算出四种主要过敏原的提取率分别为60.0%、52.1%、29.6%和90.2%。如图1，为实施例中离子交换层析曲线示意图。如图2为实施例中过敏原蛋白SDS-PAGE的分离图，右图为浓缩后的溶菌酶和卵转铁蛋白。由于卵类黏蛋白含20%-25%的糖基成分，电泳时分子量显示偏大，条带弥散属正常现象。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡蛋清过敏原分离方法，其特征步骤为：1）、鸡蛋清处理液配制：新鲜鸡蛋去壳并分离出蛋清，冰浴中用玻璃棒缓慢搅拌至没有块状物质后，加入等体积蒸馏水并用1M盐酸调pH至6.0，4℃搅拌3h后，3000g离心10分钟；收集上清液，用1M盐酸调pH到3.8，4℃搅拌3h后再次离心，收集上清液于‑20℃冻存备用；2）、层析柱制备：取GE公司的CM‑sepharose FF柱材，蒸馏水置换5‑6次除去酒精，按常规装柱1.6cm×20cm，最终柱体积为30ml；3）、层析分离：用20 mmol/L 醋酸‑醋酸钠 pH4.0平衡柱子，至紫外监测仪读数稳定；上样5ml鸡蛋清处理液，控制流速在1.5ml/min，待穿过峰洗出后换上含0～0.2mol/L NaCl 醋酸‑醋酸钠 pH4.3 洗脱，200min后换成用含0.1～0.2mol/L NaCl 醋酸‑醋酸钠 pH5.5 洗脱；待315 min时第4峰出峰结束，换上含0～0.4 mol/L NaCl PBS缓冲液 pH7.4 洗脱，直至出完最后两峰，分离结束；4）、蛋白纯度检测：将分离所得蛋白收集，取样10μl与10μl上样缓冲液混合后，取15μl加入聚丙烯酰胺凝胶 SDS‑PAGE 胶孔内，电泳后，凝胶经考马斯亮蓝显色进行检测；5）、蛋白质的浓缩：将收集到的四种蛋白质纯品用PEG浓缩，透析后冻干，于‑20℃冻存。...

【技术特征摘要】
1.一种鸡蛋清过敏原分离方法，其特征步骤为：1）、鸡蛋清处理液配制：新鲜鸡蛋去壳并分离出蛋清，冰浴中用玻璃棒缓慢搅拌至没有块状物质后，加入等体积蒸馏水并用1M盐酸调pH至6.0，4℃搅拌3h后，3000g离心10分钟；收集上清液，用1M盐酸调pH到3.8，4℃搅拌3h后再次离心，收集上清液于-20℃冻存备用；2）、层析柱制备：取GE公司的CM-sepharoseFF柱材，蒸馏水置换5-6次除去酒精，按常规装柱1.6cm×20cm，最终柱体积为30ml；3）、层析分离：用20mmol/L醋酸-醋酸钠pH4.0平衡柱子，至紫外监测仪读数稳定；上样5ml鸡蛋清处理液，控制流速在1.5ml/min，待穿过峰洗出后换上含0～0.2mo...

【专利技术属性】
技术研发人员：麻小娟，梁汭，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52