FvCPC2蛋白及其编码基因在调控多种食用菌菌丝生长和子实体发育中的应用制造技术

本发明专利技术公开了FvCPC2蛋白及其编码基因在调控多种食用菌菌丝生长和子实体发育中的应用。本发明专利技术通过对金针菇中Fvcpc2的过表达和敲低表达实验发现，Fvcpc2影响金针菇菌丝在平板和栽培料中的生长，同时决定着金针菇原基的形成及子实体的发育，可将Fvcpc2应用到金针菇优良菌种的选育中。同时，通过对粗糙脉孢菌的回补实验发现，Fvcpc2能够取代粗糙脉孢菌中cpc‑2菌丝生长和子实体发育的调控功能，这说明Fvcpc2在担子菌和子囊菌中不仅普遍存在，而且其对子实体发育的调控功能具有普适性，能够应用到不同的食用菌的育种中。本发明专利技术的Fvcpc2是在食用菌中的首次发现，更是在食用菌基因工程育种中的首次应用。

Application of FvCPC2 protein and its coding genes in regulation of mycelial growth and fruiting body development of many edible fungi

The invention discloses the application of FvCPC2 protein and its coding gene in regulating the mycelial growth and fruiting body development of various edible fungi. By overexpressing and knocking down Fvcpc2 in Flammulina velutipes, it is found that Fvcpc2 affects the growth of Flammulina velutipes hyphae in flat plate and cultivation material, determines the formation of Flammulina velutipes primordium and the development of fruiting bodies, and Fvcpc2 can be applied to the breeding of Flammulina velutipes excellent strains. At the same time, it was found that Fvcpc2 could replace the regulation function of mycelium growth and fruiting body development in Neurospora crassa, which indicated that Fvcpc2 was not only ubiquitous in basidiomycetes and ascomycetes, but also could be applied to different food. In the breeding of bacteria. The Fvcpc2 of the invention is first discovered in edible fungi, and is the first application in genetic engineering breeding of edible fungi.

【技术实现步骤摘要】
FvCPC2蛋白及其编码基因在调控多种食用菌菌丝生长和子实体发育中的应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及FvCPC2蛋白在调控多种食用菌(包括真姬菇、双孢菇、灵芝、香菇、金针菇和草菇)菌丝生长和子实体发育中的应用，以及一株具有出菇周期短、产量高的金针菇Fvcpc2过表达突变菌株(Fvcpc2OE#5)。
技术介绍
食用菌是指能形成大型子实体或菌核类组织，并能供人们食用或药用的菌类(张维东等，园艺特产，2017)，目前我国约有1000多种食用菌(戴玉成等，菌物学报，2010.29:p.625-628.)，大部分属于担子菌，小部分属于子囊菌。食用菌含有丰富的多糖、蛋白质、三萜类、多肽、膳食纤维、牛磺酸、甘露醇、不饱和脂肪酸、腺嘌呤核苷、内脂、矿物质和维生素等(Mattila,P.,etal.,.Journalofagriculturalandfoodchemistry,2001.49(5):p.2343-2348；Gao,Y.,etal.,JOURNALOFMEDICINALFOOD,2005.8(2)；Agrahar-Murugkar,D.andG.Subbulakshmi,FoodChemistry,2005.89(4):p.599-603；Barros,L.,etal.,Journalofagriculturalandfoodchemistry,2008.56(10):p.3856-3862；Ouzouni,P.K.,etal.,FoodChemistry,2009.115(4):p.1575-1580；周素娟等，中国食用菌,2015.3(1):p.4-6)，同时具有低盐、低脂、低糖和高蛋白质的特点，被营养学家推荐为十大健康食品之一，具有巨大的市场前景和开发潜力(杨文建等，食药用菌，2011.19(1):p.15-18.)。其中金针菇(Flammulinavelutipes)是典型的食用菌，在全世界尤其是亚洲国家广泛栽培(Chang,S.T.andJ.A，WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology,1996.12:p.473-476)。金针菇含有丰富营养物质，同时因为其生长周期短，出菇条件简单而成为研究食用菌发育的代表菌株。随着我国食用菌产值比重的上升以及在国际市场占有率的提高(李哲敏等，中国食物与营养，2005.5(10):p.15-17；卢敏等，中国食用菌学报，2006.13(1):p.1-5)，对于食用菌增产技术的需求越来越迫切。目前的增产方式主要包括优化营养条件和遗传育种。营养条件的优化包括添加促增产物质、优化栽培料配方以及改良栽培方式。比如在香菇栽培中添加食用菌增产剂，在金针菇栽培中添加三十烷醇等促增产物质；或选用更合适的碳源、氮源促进菌丝在栽培料上的生长；或者通过采用定位出菇、红光诱导出菇等栽培方式促进子实体生长(夏志兰，湖南农业大学学报，2002.01；潘继红等，食用菌学报，1992.06；金群力等，浙江农业学报，2016.11；邓春海等，食用菌，2013.03；张金红，河北科技报.2017)。这些改进方法主要针对菌株生长的环境进行改变从而更有利于菌株生长，但是增产空间有限且成本高。而遗传育种是通过改变菌株的性状以适应不同的生长环境，目前应用于食用菌遗传育种的方式主要包括人工选择育种、诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种和基因工程育种。例如通过人工选育而得到的优良香菇品种广香5号，60Co诱变选育姬松茸氨基酸高产菌株J3，经过不同亲本交配得到的早熟金针菇“农金六号”(吴学谦，香菇生产全书，2005；江枝和等，西北农业学报，2003.12(3):p.129-132；刘新锐等，园艺学报，2014.02)。以上三种育种方法在分子生物学发展初期较为常用，虽然能选育出性状优良的菌株，但是筛选较为盲目，而且耗费人工和时间。另外两种是原生质体融合育种和基因工程育种，其中已经有关于杏鲍菇和秀珍菇(张鹏，福建农林大学，2012)以及金针菇和巨大口蘑(郑锦荣，华南农业大学，2016)在原生质体融合育种方法层面的研究，但是融合子增强的性状仅限于两个亲本已经具有的性状，难以获得新的性状。而基因工程育种是在基因水平上的遗传操作，可以将任意一个有功能的基因导入受体细胞中复制表达，从而选育出新品种。基因工程育种为选育更优良性状的食用菌菌种带来了曙光，这一技术需要基于对子实体发育调控基因的深入研究。随着分子生物学在食用菌中的应用，逐渐有一些关于调控食用菌子实体发育基因的报道。如草菇的漆酶基因lac1、lac4，香菇的疏水蛋白基因Le.hyd1、Le.hyd2，金针菇的腺苷脱氨酶编码基因Fv-ada和交配型基因等(Chen,S.,etal.,EuropeanJournalofBiochemistry,2004.271(2):p.318-328；Chen,S.,etal.,FEMSMicrobiologyLetters,2004.230(2):p.170-176；Ng,W.L.,etal.,FEMSMicrobiolLett,2000.185(2):p.139-145；Wang,W.,etal.,G3(Bethesda),2016)。这些研究目前局限于对单个物种的研究，在不同食用菌中还不具有普遍适用性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何调控食用菌菌丝生长和子实体发育，培育出产量高、出菇周期短的食用菌。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了来源于金针菇的FvCPC2蛋白质的新用途。本专利技术提供了FvCPC2蛋白质在如下任一中的应用：(a1)调控食用菌菌丝生长；(a2)调控食用菌子实体发育；(a3)调控食用菌生物量和/或产量；(a4)调控食用菌出菇周期；(a5)调控真菌菌丝生长；(a6)调控真菌子实体发育；(a7)调控真菌产孢水平。所述FvCPC2蛋白质是由7个WD40重复序列构成的Gβ类蛋白，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述d)中，“同源性”包括与本专利技术的序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.FvCPC2蛋白质在如下任一中的应用：(a1)调控食用菌菌丝生长；(a2)调控食用菌子实体发育；(a3)调控食用菌生物量和/或产量；(a4)调控食用菌出菇周期；(a5)调控真菌菌丝生长；(a6)调控真菌子实体发育；(a7)调控真菌产孢水平；所述FvCPC2蛋白质为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.FvCPC2蛋白质在如下任一中的应用：(a1)调控食用菌菌丝生长；(a2)调控食用菌子实体发育；(a3)调控食用菌生物量和/或产量；(a4)调控食用菌出菇周期；(a5)调控真菌菌丝生长；(a6)调控真菌子实体发育；(a7)调控真菌产孢水平；所述FvCPC2蛋白质为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。2.与权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质相关的生物材料在如下任一中的应用：(a1)调控食用菌菌丝生长；(a2)调控食用菌子实体发育；(a3)调控食用菌生物量和/或产量；(a4)调控食用菌出菇周期；(a5)调控真菌菌丝生长；(a6)调控真菌子实体发育；(a7)调控真菌产孢水平；所述与权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：A1)编码权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述调控为促进或提高；或，所述调控食用菌生物量和/或产量体现在如下(c1)-(c3)中任一种：(c1)提高食用菌子实体数量；(c2)提高食用菌子实体高度；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李少杰，吴塔菊，孙宪昀，张振颖，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11