雌酮酶联免疫检测试剂盒及其检测方法和应用技术

技术编号:19135509 阅读:35 留言:0更新日期:2018-10-13 08:02
本发明专利技术涉及酶联免疫检测技术领域,是一种雌酮酶联免疫检测试剂盒及其检测方法和应用,该雌酮酶联免疫检测试剂盒,包括包被有雌酮单克隆抗体的多孔酶标板、酶标记物、雌酮标准品溶液、底物显色液A、底物显色液B、样本稀释液、酶标记物稀释液、第一浓缩洗涤液、第二浓缩洗涤液、终止液。本发明专利技术提供了一种雌酮酶联免疫试剂盒及其检测方法和应用,其检测方法主要包括:先进行样本前处理,再用试剂盒进行检测,最后分析检测结果。本发明专利技术雌酮酶联免疫检测试剂盒可应用于怀孕母马尿液中雌酮的检测,也可应用于临床中血液雌酮浓度的检测,本发明专利技术具有操作简便、快速、准确、灵敏度高和费用低的特点,适合大量样本的筛查和现场监控。

Estrone ELISA kit and its detection method and Application

The invention relates to the technical field of enzyme-linked immunoassay (ELISA), which is an enzyme-linked immunoassay kit for estrone and its detection method and application. The ELISA kit comprises a porous enzyme label plate coated with monoclonal antibody against estrone, an enzyme label, an estrone standard solution, a substrate chromogenic solution A, a substrate chromogenic solution B, and a sample. Diluent, enzyme labelled diluent, first concentration washing solution, second concentrated washing liquid, and stop liquid. The invention provides an enzyme-linked immunoassay kit for estrone and its detection method and application. The detection method mainly comprises: sample pretreatment, detection with the kit, and finally analysis of the detection results. The enzyme-linked immunoassay kit for estrone can be used for the detection of estrone in the urine of pregnant mares, and can also be used for the detection of blood estrone concentration in clinical practice. The kit has the characteristics of simple operation, rapid, accurate, high sensitivity and low cost, and is suitable for the screening of a large number of samples and on-site monitoring.

【技术实现步骤摘要】
雌酮酶联免疫检测试剂盒及其检测方法和应用
本专利技术涉及酶联免疫检测
,是一种雌酮酶联免疫检测试剂盒及其检测方法和应用。
技术介绍
雌酮是一种甾体激素类化合物,具有环戊烷并多氢菲母核,为天然内源性雌激素,可从孕妇或孕马的妊娠尿液中提取而得。自美国惠氏公司开创了更年期女性的激素补充疗法后,从孕马尿中提取结合态雌激素制备此类药物制剂已成为目前的一个主要方向。根据文献报道雌激素替代疗法范围越来越广泛。因而,使从孕马尿中提取雌激素的生产规模也越来越大。目前,雌酮检测常采用GC、HPLC、GC-MS、TLC等各种仪器分析法,孕马尿中结合态雌激素提取检测也主要借助于HPLC、GC分析方法。因随市场需求量的激增,孕马尿采集量也大幅度增加,从而导致色谱检测法作为孕马尿原料质控手段与需检测样本大幅度增加相比出现了一定的局限性。因此有必要建立一种简单快速、灵敏度高、经济、适宜于采集现场监测孕马尿原料中主要活性成分雌酮的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种雌酮酶联免疫检测试剂盒及其检测方法和应用,克服了上述现有技术之不足,可应用于怀孕母马尿液中雌酮的检测,也可应用于临床中血液雌酮浓度的检测,具有操作简便、快速、准确、灵敏度高和费用低的特点,适合大量样本的筛查和现场监控。本专利技术的技术方案之一是通过以下措施来实现的:一种雌酮酶联免疫检测试剂盒,包括多孔酶标板、酶标记物、雌酮标准品溶液、底物显色液A、底物显色液B、样本稀释液、酶标记物稀释液、第一浓缩洗涤液、第二浓缩洗涤液、终止液,其中,多孔酶标板包被有雌酮单克隆抗体,酶标记物中的酶为辣根过氧化物酶,辣根过氧化物酶标记的抗原为雌酮抗原中的雌酮-6-SCH2CO2H-OVA,雌酮抗原包括雌酮免疫原和雌酮包被原,雌酮-6-SCH2CO2H-OVA为雌酮半抗原与载体蛋白中卵清蛋白的偶联物,雌酮半抗原的分子结构式为下面是对上述专利技术技术方案之一的进一步优化或/和改进:上述雌酮标准品溶液的浓度范围为0μg/mL至100μg/mL;或/和,底物显色液A为含体积百分含量0.05%至0.08%过氧化氢尿素的磷酸钠柠檬酸溶液;或/和,底物显色液B为含体积百分含量0.04%至0.05%四甲基联苯胺的酸性稳定液;或/和,样本稀释液为小牛血清和磷酸盐缓冲液的混合液,其中,样本稀释液中,小牛血清的体积百分含量为5%至15%,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01moL/L、pH值为7.2至7.4;或/和,酶标记物稀释液为磷酸盐缓冲液和小牛血清的混合液,其中,酶标记物稀释液中,小牛血清的体积百分含量为10%至20%,磷酸盐缓冲液中含有体积百分含量为1%的吐温-20,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01moL/L、pH值为7.2至7.4;或/和,第一浓缩洗涤液为含有体积百分含量为1%的吐温-20的磷酸盐缓冲液,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.2moL/L、pH值为7.2至7.4;或/和,第二浓缩洗涤液为摩尔浓度为2%的乙酸溶液;或/和,第二浓缩洗涤液为摩尔浓度为2%的乙酸溶液。上述在于雌酮单克隆抗体为雌酮鼠源单克隆抗体、雌酮兔源单克隆抗体、雌酮羊源单克隆抗体,是用雌酮免疫原免疫动物后,取抗血清效价为1:2000至1:100000的动物脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合培养筛选得到的可稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株。上述多孔酶标板按照下述步骤得到:第一步,在微孔中用包被缓冲液将雌酮单克隆抗体稀释成1.0μg/mL至5.0μg/mL的稀释液,其中,每孔雌酮单克隆抗体中加入100μL包被缓冲液,包被缓冲液是摩尔浓度为0.05moL/L、pH值为9.6的的碳酸盐缓冲液;第二步,稀释液在37℃环境中避光孵育2h或在4℃环境中过夜,倾去孔中液体,用第一浓缩洗涤液稀释20倍后洗涤3次至5次,拍干后,每孔中加入180μL至200μL封闭液,在37℃环境中避光孵育2h,倾去孔中液体,用第一浓缩洗涤液洗涤3次至5次,拍干后真空密闭,得到包被有雌酮单克隆抗体的多孔酶标板,其中,封闭液为含有体积百分含量为2%至5%鱼胶蛋白、5%至10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液的混合液,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01moL/L、pH值为7.2至7.4。上述雌酮免疫原按照下述步骤得到:第一步,将20mg雌酮半抗原与1mL至5mLN,N-二甲基亚酰胺混合溶解,加入20μL至28μL三正丁胺并搅拌反应30min后,加入17μL至18μL氯甲酸已丁酯,得到第一溶液,第二步,将60mg至90mg牛血清蛋白与5mL磷酸盐缓冲液混合后,在4℃的条件下静置30min,得到第二溶液,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01moL·L-1,pH值为7.2至7.4,第三步,将第一溶液滴入第二溶液中并搅拌得到混合液,混合液在4℃条件下搅拌反应18h,第四步,将混合液与磷酸盐缓冲液混合后,于4℃下透析48h,得到雌酮免疫原,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.05moL·L-1,pH值为7.2至7.4;或/和,雌酮包被原按照下述步骤得到:第一步,将20mg雌酮半抗原与1mL至5mLN,N-二甲基亚酰胺混合溶解,加入20μL至28μL三正丁胺并搅拌反应30min后,加入17μL至18μL氯甲酸已丁酯,得到第一溶液,第二步,将60mg至90mg卵清蛋白与5mL至10mL磷酸盐缓冲液混合后,在4℃的条件下静置30min,得到第二溶液,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01moL·L-1,pH值为7.2至7.4,第三步,将第一溶液滴入第二溶液中并搅拌得到混合液,混合液在4℃条件下搅拌反应18h,第四步,将混合液与磷酸盐缓冲液混合后,于4℃下透析48h,得到雌酮包被原,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.05moL·L-1,pH值为7.2至7.4。上述雌酮半抗原按照下述制备步骤得到:第一步,室温下,依次向含有270mg雌酮的4mL二甲基甲酰胺溶液中加入225mg至280mg碳酸钾、摩尔浓度为6.7moL/L至8.3moL/L的苄基溴,得到第一混合液,搅拌混合液26h至27h,用水猝灭反应,经乙酸乙酯萃取第一混合液,合并萃取液中有机层,并洗涤、干燥、过滤有机层,收集滤渣,用乙醚洗涤滤渣,得到第一白色固体产物;第二步,将第一白色固体产物、59.1mg至70.2mg新戊二醇和0.52g至0.73g对甲苯磺酸加入到3.4mL苯中,常温下搅拌回流90min并移走水分,冷却至室温,加入饱和碳酸氢钠溶液得到第二混合液,经乙醚萃取第二混合液,得到的萃取液经水洗后,用无水硫酸镁干燥并过滤、浓缩,收集残留物,残留物经硅胶柱纯化,得到第一无色透明固体,其中,硅胶柱中洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:60;第三步,第一无色透明固体与甲苯溶解后,与215mg至248mg高锰酸钾、10mg至32mg碳酸氢钠和水混合,氮气作为保护气体,加入30.1mg至47.9mg甲基三烷基氯化铵,在95℃至100℃条件下油浴加热,搅拌17h至19h,得到第三混合液,第三混合液冷却至室温,用硅藻土过滤,得到的滤液用乙醚萃取三次,合并萃取液中有机层,水洗涤有机层,洗涤后的有机层用无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩后,经硅胶柱纯化,得到第二白色固体产物,其中,硅胶柱中洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯,石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:13;第四步,将第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于包括多孔酶标板、酶标记物、雌酮标准品溶液、底物显色液A、底物显色液B、样本稀释液、酶标记物稀释液、第一浓缩洗涤液、第二浓缩洗涤液、终止液,其中,多孔酶标板包被有雌酮单克隆抗体,酶标记物中的酶为辣根过氧化物酶,辣根过氧化物酶标记的抗原为雌酮抗原中的雌酮‑6‑SCH2CO2H‑OVA,雌酮抗原包括雌酮免疫原和雌酮包被原,雌酮‑6‑SCH2CO2H‑OVA为雌酮半抗原与载体蛋白中卵清蛋白的偶联物,雌酮半抗原的分子结构式为

【技术特征摘要】
1.一种雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于包括多孔酶标板、酶标记物、雌酮标准品溶液、底物显色液A、底物显色液B、样本稀释液、酶标记物稀释液、第一浓缩洗涤液、第二浓缩洗涤液、终止液,其中,多孔酶标板包被有雌酮单克隆抗体,酶标记物中的酶为辣根过氧化物酶,辣根过氧化物酶标记的抗原为雌酮抗原中的雌酮-6-SCH2CO2H-OVA,雌酮抗原包括雌酮免疫原和雌酮包被原,雌酮-6-SCH2CO2H-OVA为雌酮半抗原与载体蛋白中卵清蛋白的偶联物,雌酮半抗原的分子结构式为2.根据权利要求1所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于雌酮标准品溶液的浓度范围为0μg/mL至100μg/mL;或/和,底物显色液A为含体积百分含量0.05%至0.08%过氧化氢尿素的磷酸钠柠檬酸溶液;或/和,底物显色液B为含体积百分含量0.04%至0.05%四甲基联苯胺的酸性稳定液;或/和,样本稀释液为小牛血清和磷酸盐缓冲液的混合液,其中,样本稀释液中,小牛血清的体积百分含量为5%至15%,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01moL/L、pH值为7.2至7.4;或/和,酶标记物稀释液为磷酸盐缓冲液和小牛血清的混合液,其中,酶标记物稀释液中,小牛血清的体积百分含量为10%至20%,磷酸盐缓冲液中含有体积百分含量为1%的吐温-20,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01moL/L、pH值为7.2至7.4;或/和,第一浓缩洗涤液为含有体积百分含量为1%的吐温-20的磷酸盐缓冲液,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.2moL/L、pH值为7.2至7.4;或/和,第二浓缩洗涤液为摩尔浓度为2%的乙酸溶液;或/和,第二浓缩洗涤液为摩尔浓度为2%的乙酸溶液。3.根据权利要求1或2所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于雌酮单克隆抗体为雌酮鼠源单克隆抗体、雌酮兔源单克隆抗体、雌酮羊源单克隆抗体,是用雌酮免疫原免疫动物后,取抗血清效价为1:2000至1:100000的动物脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合培养筛选得到的可稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株。4.根据权利要求1或2或3所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于多孔酶标板按照下述步骤得到:第一步,在微孔中用包被缓冲液将雌酮单克隆抗体稀释成1.0μg/mL至5.0μg/mL的稀释液,其中,每孔雌酮单克隆抗体中加入100μL包被缓冲液,包被缓冲液是摩尔浓度为0.05moL/L、pH值为9.6的的碳酸盐缓冲液;第二步,稀释液在37℃环境中避光孵育2h或在4℃环境中过夜,倾去孔中液体,用第一浓缩洗涤液稀释20倍后洗涤3次至5次,拍干后,每孔中加入180μL至200μL封闭液,在37℃环境中避光孵育2h,倾去孔中液体,用第一浓缩洗涤液洗涤3次至5次,拍干后真空密闭,得到包被有雌酮单克隆抗体的多孔酶标板,其中,封闭液为含有体积百分含量为2%至5%鱼胶蛋白、5%至10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液的混合液,磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01moL/L、pH值为7.2至7.4。5.根据权利要求1或2或3或4所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于雌酮免疫原按照下述步骤得到:第一步,将20mg雌酮半抗原与1mL至5mLN,N-二甲基亚酰胺混合溶解,加入20μL至28μL三正丁胺并搅拌反应30min后,加入17μL至18μL氯甲酸已丁酯,得到第一溶液,第二步,将60mg至90mg牛血清蛋白与5mL磷酸盐缓冲液混合后,在4℃的条件下静置30min,得到第二溶液,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01moL·L-1,pH值为7.2至7.4,第三步,将第一溶液滴入第二溶液中并搅拌得到混合液,混合液在4℃条件下搅拌反应18h,第四步,将混合液与磷酸盐缓冲液混合后,于4℃下透析48h,得到雌酮免疫原,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.05moL·L-1,pH值为7.2至7.4;或/和,雌酮包被原按照下述步骤得到:第一步,将20mg雌酮半抗原与1mL至5mLN,N-二甲基亚酰胺混合溶解,加入20μL至28μL三正丁胺并搅拌反应30min后,加入17μL至18μL氯甲酸已丁酯,得到第一溶液,第二步,将60mg至90mg卵清蛋白与5mL至10mL磷酸盐缓冲液混合后,在4℃的条件下静置30min,得到第二溶液,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.01moL·L-1,pH值为7.2至7.4,第三步,将第一溶液滴入第二溶液中并搅拌得到混合液,混合液在4℃条件下搅拌反应18h,第四步,将混合液与磷酸盐缓冲液混合后,于4℃下透析48h,得到雌酮包被原,其中,磷酸盐缓冲液的浓度为0.05moL·L-1,pH值为7.2至7.4。6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的雌酮酶联免疫检测试剂盒,其特征在于雌酮半抗原按照下述制备步骤得到:第一步,室温下,依次向含有270mg雌酮的4mL二甲基甲酰胺溶液中加入225mg至280mg碳酸钾、摩尔浓度为6.7moL/L至8.3moL/L的苄基溴,得到第一混合液,搅拌混合液26h至27h...

【专利技术属性】
技术研发人员:巩月红温浩高晓黎王建华赵军段新宇孙其何丽平
申请(专利权)人:新疆医科大学第一附属医院新疆医科大学
类型:发明
国别省市:新疆,65

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