基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物的检测方法技术

技术编号:19135131 阅读:67 留言:0更新日期:2018-10-13 07:59
本发明专利技术提供了一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的代谢性标志物联检方法,该方法采用同位素标记的氨基酸标准品及同位素标记的肉碱标准品作为内标、以高浓度质控血片和低浓度质控血片作为阳性对照,结合了乙腈‑水溶液为流动相,采用母离子扫描、中性丢失扫描和多反应离子监测多种扫描方式联用的超高效液相色谱串联质谱仪检测条件的合理设置,可实现仅需要低至3μL极少量的血液样品,且仅需一次检测,即可完成对134多种包括氨基酸和肉碱类代谢物的定性和定量分析,该发明专利技术具有所需样品量少,高灵敏度,高准确度,高通量,高重复性等优点,适合于大规模的临床干血片样品的分析应用。

Detection of metabolites in neonates based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

The invention provides a metabolic marker detection method based on ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. The method uses isotope-labeled amino acid standard and isotope-labeled carnitine standard as internal standard, high-concentration quality control blood tablets and low-concentration quality control blood tablets as positive control, and combines acetonitrile with water. Reasonable settings of detection conditions for ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS) using mother ion scanning, neutral loss scanning and multi-reaction ion monitoring as mobile phases can realize the detection of 134 kinds of amino acids including only a very small amount of blood samples as low as 3 mu L. Qualitative and quantitative analysis of carnitine metabolites, the invention has the advantages of small sample size, high sensitivity, high accuracy, high throughput, high repeatability and other advantages, suitable for large-scale clinical dry blood sample analysis applications.

【技术实现步骤摘要】
基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物的检测方法
本专利技术涉及代谢物检测领域,具体涉及了一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物的检测方法。
技术介绍
细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的,如细胞信号释放(cellsignaling)、能量传递、细胞间通信等都是受代谢物调控的。代谢物调控涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、碳水化合物、类固醇等多种物质,其种类繁多,使得代谢网络错综复杂,通过对代谢产物进行检测分析,可用于寻找疾病的生物标记物,建立代谢指纹图谱。传统的对代谢物水平的检查主要依赖实验室的特异性检查,一项实验只能检测一种代谢物,该方法需要样品量大,且周期长、准确度较低。同时,由于代谢物的特殊性,对其含量水平变化检测的重复性、准确度、灵敏度偏低,导致检测时容易出现假阴性和假阳性判断。因此,有必要提供一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的,消耗少量样品,即可实现高灵敏度、高准确度、高通量和高重复性的代谢物检测方法。
技术实现思路
基于此,本专利技术的目的是提供一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的,样品用量少、且高灵敏度、高准确度、高通量和高重复性的代谢物检测方法。具体技术方案如下:一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物检测方法,包括以下步骤:(1)制备待测样品:用含内标的萃取液萃取样品血片中的代谢物后,进行衍生化反应;所述内标为同位素标记的氨基酸标准品及同位素标记的肉碱标准品;(2)设置空白滤纸片作为空白对照,质控血片作为阳性对照,所述质控血片包括高浓度质控血片和低浓度质控血片;(3)对所述待测样品、空白对照和阳性对照用超高效液相色谱串联质谱仪检测;所述超高效液相色谱串联质谱仪检测的条件包括:样品进样量为10-20μl;乙腈水溶液为流动相;毛细管的雾化;经电喷雾离子源电离;采用母离子扫描、中性丢失扫描和多反应离子监测三种扫描方式中至少一种方式进行扫描。在其中一些实施例中,所述同位素标记的氨基酸标准品包括同位素标记的:L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-天冬氨酸、L-精氨酸盐酸盐、甘氨酸、L-瓜氨酸和DL-谷氨酸;所述同位素标记的肉碱标准品包括同位素标记的:左旋肉碱、L-肉豆蔻酰基肉碱、L-乙酰基肉碱、L-棕榈酰基肉碱、L-丙酰基肉碱、L-异戊酰基肉碱、L-丁酰基肉碱和L-辛酰基肉碱。在其中一些实施例中,所述同位素标记的氨基酸标准品为CambridgeIsotopeLaboratories的NSK-A;所述同位素标记的肉碱标准品为CambridgeIsotopeLaboratories的NSK-B。在其中一些实施例中,所述高浓度质控为Chromsystemsinstruments&ChemicalsGmbH,0193;所述低浓度质控为Chromsystemsinstruments&ChemicalsGmbH,0192。在其中一些实施例中,步骤(1)所述制备待测样品包括:(1)血样采集:采血、滴于滤纸片上,使其自然均匀渗透至滤纸片得7-8mm血斑,室温风干后,在血样均匀分散的滤纸片用打孔器打孔,孔径为3-3.4mm,得样品血片;(2)样品前处理:向样品血片中加入含内标的萃取液对血片中的代谢标志物进行萃取;离心并转移萃取液,于48-52℃氮气吹干;加入衍生化试剂并在加热条件下密闭反应,于48-52℃氮气吹干;加入80%的乙腈水溶液,震荡混匀复溶,准备上机进样。在其中一些实施例中,所述含内标的萃取液由以下方法制备得到:取适量的同位素标记的氨基酸标准品和同位素标记的肉碱标准品,溶于适量甲醇水溶液,超声,即得;及/或所述衍生化试剂由以下方法制备得到:冰浴条件下,将乙酰氯按照1:(8.5-9.5)的比例加入到正丁醇中,即得。在其中一些实施例中,所述含内标的萃取液由以下方法制备得到:(1)向所述同位素标记的氨基酸标准品CambridgeIsotopeLaboratories,NSK-A和所述同位素标记的肉碱标准品CambridgeIsotopeLaboratories,NSK-B中分别加入体积百分比为(50±1)%的甲醇水溶液(1±0.1)ml进行溶解,超声20min,得NSK-A内标储备液和NSK-B内标储备液;(2)量取8-12ml甲醇,分别加入55μlNSK-A内标储备溶液和55μlNSK-B内标储备溶液,振摇2min以混合均匀,即得。在其中一些实施例中,所述超高效液相色谱串联质谱仪检测包括:超高效液相色谱条件为:采用体积百分比为(80±2)%的乙腈水溶液作为流动相,0-0.12min流速为0.200mL/min,0.12-1.12min流速为0.016mL/min,1.12-1.60min时流速为0.200mL/min;质谱条件为:源温度120℃,电离源毛细管压力3.0KV,样品锥孔电压50.0V,脱溶剂气温度350℃,脱溶剂气流量800L/hr,锥孔气流量50.0L/hr。在其中一些实施例中,所述中性丢失扫描,用于检测酸性和中性氨基酸;所述母离子扫描用于检测酰基肉毒碱;所述中性丢失扫描、母离子扫描与多反应离子监测三种扫描方式联合使用,用于同时对氨基酸、脂肪酸进行综合检测分析。在其中一些实施例中,所述新生儿代谢物包括以下氨基酸:Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Hcy、His、Leu、Lys、Met、Orn、Phe、Pip、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val;以下酰基肉碱:C0、C2、C3、C4、C4-OH、C4DC、C5、C5-OH、C5DC、C5:1、C6、C8、C10、C12、C14、C14-OH、C14DC、C14:1、C16、C16-OH、C16:1-OH、C18、C20、C22、C24、C26、C6:1、C6-OH、C8:1、C8:2、C8DC、C10DC、C12:1、C12:2、C12-OH、C12DC、C16:1、C16:2、C16DC、C18DCC18:1、C18-OH、C18:1-OH、C10:1、C10:2、C14:2、C18:2、C6DC;和以下代谢物间比值:Arg/Orn、Cit/Arg、Gly/Ala、Met/Leu、Met/Phe、Orn/Cit、Phe/Tyr、Tyr/Cit、Val/Phe、Cit/Phe、Glu/Phe、Glu/Cit、Gly/Phe、His/Phe、Leu/Phe、Thr/Phe、Trp/Phe、Tyr/Phe、C2/C0、C3/C0、C3/C2、C3/C16、C4/C2、C4/C3、C4/C8、C5/C0、C5/C2、C5/C3、C5-OH/C8、C5-OH/C0、C5DC/C5-OH、C5DC/C16、C8/C2、C8/C10、C16-OH/C16、C26/C20、C14:1/C16、C3DC、C3DC/C10、C5DC/C8、(0+2+3+16+18:1)/Cit、(C16+C18)/C0、C0/(C16+C18)、C3/Met、C3DC/C4、C4-OH/C2、C4-OH/C3、C5-OH/C3、C5DC/C3、C6/C3、C8/C3、C10/C3、C12/C3、C14/C3、C14:1/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)制备待测样品:用含内标的萃取液萃取样品血片中的代谢物后,进行衍生化反应;所述内标为同位素标记的氨基酸标准品及同位素标记的肉碱标准品;(2)设置空白滤纸片作为空白对照,质控血片作为阳性对照,所述质控血片包括高浓度质控血片和低浓度质控血片;(3)对所述待测样品、空白对照和阳性对照用超高效液相色谱串联质谱仪检测;所述超高效液相色谱串联质谱仪检测的条件包括:样品进样量为10‑20μl;乙腈水溶液为流动相;毛细管的雾化;经电喷雾离子源电离;采用母离子扫描、中性丢失扫描和多反应离子监测三种扫描方式中至少一种方式进行扫描。

【技术特征摘要】
2017.06.22 CN 20171048179601.一种基于超高效液相色谱串联质谱技术的新生儿代谢物的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)制备待测样品:用含内标的萃取液萃取样品血片中的代谢物后,进行衍生化反应;所述内标为同位素标记的氨基酸标准品及同位素标记的肉碱标准品;(2)设置空白滤纸片作为空白对照,质控血片作为阳性对照,所述质控血片包括高浓度质控血片和低浓度质控血片;(3)对所述待测样品、空白对照和阳性对照用超高效液相色谱串联质谱仪检测;所述超高效液相色谱串联质谱仪检测的条件包括:样品进样量为10-20μl;乙腈水溶液为流动相;毛细管的雾化;经电喷雾离子源电离;采用母离子扫描、中性丢失扫描和多反应离子监测三种扫描方式中至少一种方式进行扫描。2.根据权利要求1所述的新生儿代谢物的检测方法,其特征在于,所述同位素标记的氨基酸标准品包括同位素标记的:L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-鸟氨酸盐酸盐、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、L-天冬氨酸、L-精氨酸盐酸盐、甘氨酸、L-瓜氨酸和DL-谷氨酸;所述同位素标记的肉碱标准品包括同位素标记的:左旋肉碱、L-肉豆蔻酰基肉碱、L-乙酰基肉碱、L-棕榈酰基肉碱、L-丙酰基肉碱、L-异戊酰基肉碱、L-丁酰基肉碱和L-辛酰基肉碱。3.根据权利要求2所述的新生儿代谢物的检测方法,其特征在于,所述同位素标记的氨基酸标准品为CambridgeIsotopeLaboratories的NSK-A;所述同位素标记的肉碱标准品为CambridgeIsotopeLaboratories的NSK-B。4.根据权利要求1所述的新生儿代谢物的检测方法,其特征在于,所述高浓度质控为Chromsystemsinstruments&ChemicalsGmbH,0193;所述低浓度质控为Chromsystemsinstruments&ChemicalsGmbH,0192。5.根据权利要求1-4任一项所述的新生儿代谢物的检测方法,其特征在于,步骤(1)所述制备待测样品包括:(1)血样采集:采血、滴于滤纸片上,使其自然均匀渗透至滤纸片得7-8mm血斑,室温风干后,在血样均匀分散的滤纸片用打孔器打孔,孔径为3-3.4mm,得样品血片;(2)样品前处理:向样品血片中加入含内标的萃取液对血片中的代谢标志物进行萃取;离心并转移萃取液,于48-52℃氮气吹干;加入衍生化试剂并在加热条件下密闭反应,于48-52℃氮气吹干;加入体积百分比为(80±2)%的乙腈水溶液,震荡混匀复溶,准备上机进样。6.根据权利要求5所述的新生儿代谢物的检测方法,其特征在于,所述含内标的萃取液由以下方法制备得到:取适量的同位素标记的氨基酸标准品和同位素标记的肉碱标准品,溶于适量甲醇水溶液,超声,即得;及/或所述衍生化试剂由以下方法制备得到:冰浴条件下,将乙酰氯按照1:(8.5~9.5)的体积比加入到正丁醇中,即得。7.根据权利要求6所述的新生儿代谢物的检测方法,其特征在于,所述含内标的萃取液由以下方法制备得到:(1)向所述同位素标记的氨基酸标准品CambridgeIsotopeLaboratories,NSK-A和所述同位素标记的肉碱标准品CambridgeIsotopeLaboratories,NSK-B中分别加入体积百分比为...

【专利技术属性】
技术研发人员:宁云山王宗珊周景权李妍
申请(专利权)人:南方医科大学珠海南医大生物医药公共服务平台有限公司
类型:发明
国别省市:广东,44

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1