热稳定性β-葡萄糖醛酸糖苷酶制剂制造技术

本文提供了作为水性或冻干制剂，在高温和低温两者下均表现出长期稳定性的β‑葡萄糖醛酸糖苷酶酶制剂。本发明专利技术的制剂包含β‑葡萄糖醛酸糖苷酶酶如突变β‑葡萄糖醛酸糖苷酶酶、两性化合物、L‑组氨酸、β‑丙氨酸和糖。本文还提供了制备所述制剂的方法，以及使用所述制剂水解葡萄糖醛酸苷底物(包括阿片类和苯并二氮杂

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】热稳定性β-葡萄糖醛酸糖苷酶制剂
技术介绍
在哺乳动物中，葡萄糖醛酸苷化是使用UDP葡萄醛酸基转移酶系统使化合物去毒化或失活的主要手段之一。化合物通过葡萄糖醛酸基转移酶系统缀合以形成葡萄糖醛酸苷，其然后在尿液中分泌或者在胆汁中分泌到肠道下段。β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶催化多种β-葡萄糖醛酸苷的水解。考虑到葡萄糖醛酸苷化在化合物的去毒化中的关键作用，BGUS酶已被用于检测身体样本中的药物，例如检测犯罪嫌疑人身体样本中违禁药物的存在。例如，可以通过检测BGUS对葡萄糖醛酸苷形式的药物的水解来测试身体样品中可疑药物的存在。BGUS酶对葡萄糖醛酸的水解促进了通过诸如质谱法的方法对药物的分析，因为这种分析仪器在葡萄糖醛酸的存在下较不敏感。BGUS酶的市售制备物通常作为水性制剂提供，并且可能在宽的温度范围或延长的时间段内不表现出酶稳定性。因此，需要适合于水性和冻干制剂两者的具有增强的热稳定性的BGUS酶制剂。
技术实现思路
本专利技术提供了BGUS酶制剂，其作为液体制剂或冻干制剂在低温(例如低于冰点)和高温(例如高于37℃)下均表现出热稳定性。因此，这些制剂允许冷冻/解冻，同时保持酶活性。此外，本文所述的制剂在升高的温度(＞37℃)下表现出延长的时间(例如大于10天)的酶活性，并且具有低聚集倾向，因此提供长的储存寿命。另外，制剂不含可能在某些类型的分析(例如质谱)中干扰酶的使用的赋形剂，例如洗涤剂和聚合物。因此，本专利技术的热稳定制剂可用于生物样品(例如尿样)的直接分析，具有最低限度的清除。基于对氨基酸、糖和盐的大组的分析，已经发现含有两性化合物、氨基酸L-组氨酸和β-丙氨酸以及糖的制剂表现出上文讨论的期望的热稳定性和其他有利性质。因此，在一个方面，本专利技术涉及包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、两性化合物、L-组氨酸、β-丙氨酸和糖的制剂。在一个实施方式中，两性化合物选自甜菜碱一水合物、胆碱盐、甜菜碱盐、6-氨基己酸、5-氨基戊酸和4-氨基丁酸(GABA)。在一个实施方式中，两性化合物是甜菜碱一水合物。在一个实施方式中，甜菜碱一水合物在制剂中以至少50mM的浓度存在。在另一个实施方式中，甜菜碱一水合物在制剂中以50mM-250mM的浓度存在。在又一个实施方式中，甜菜碱一水合物在制剂中以250mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。在一个实施方式中，糖选自蔗糖、山梨醇、木糖醇、甘油、2-羟丙基-β-环糊精和α-环糊精。在一个实施方式中，糖是蔗糖。在一个实施方式中，糖在制剂中以至少50mM的浓度存在。在另一个实施方式中，糖在制剂中以50mM-500mM的浓度存在。在又一个实施方式中，糖在制剂中以500mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。在一个实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以至少50mM的浓度存在。在另一个实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以50mM-250mM的浓度存在。在又一个实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以250mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。在一个实施方式中，L-组氨酸在制剂中以至少10mM的浓度存在。在另一个实施方式中，L-组氨酸在制剂中以10mM-50mM的浓度存在。在又一个实施方式中，L-组氨酸在制剂中以50mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。在一个实施方式中，BGUS酶在制剂中是重组BGUS酶。在一个实施方式中，重组BGUS酶是突变BGUS酶。在一个实施方式中，突变BGUS酶是突变大肠杆菌BGUS酶，例如具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的酶。本文公开了用于制剂的另外的适合BGUS酶。在一个实施方式中，BGUS酶在制剂中以至少1mg/ml的浓度存在。在另一个实施方式中，BGUS酶在制剂中以1-5mg/ml的浓度存在。在又一个实施方式中，BGUS酶在制剂中以5mg/ml的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。在一个实施方式中，制剂不含洗涤剂。在另一个实施方式中，制剂不含聚合物。在一个实施方式中，制剂是水性制剂。在另一个实施方式中，制剂是冻干制剂。在一个实施方式中，制剂包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、50mM甜菜碱一水合物、10mML-组氨酸、50mMβ-丙氨酸和50mM蔗糖。在一个实施方式中，该制剂还包含浓度为1mg/ml的具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的BGUS酶。在一个实施方式中，制剂是水性制剂。或者，该制剂可以是冻干制剂。在一个实施方式中，制剂包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、250mM甜菜碱一水合物、50mML-组氨酸、250mMβ-丙氨酸和250mM蔗糖。在一个实施方式中，该制剂还包含浓度为5mg/ml的具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的BGUS酶。在一个实施方式中，制剂是冻干制剂。或者，该制剂可以是水性制剂。在另一方面，本专利技术提供了制备本专利技术的制剂的方法。因此，在一个实施方式中，本专利技术提供了一种制备β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶制剂的方法，其包括：(a)制备包含BGUS酶、两性化合物、L-组氨酸和β-丙氨酸的溶液；和(b)向步骤(a)中制备的溶液中加入糖。在一个实施方式中，该方法还进一步包括冻干步骤(b)中制备的溶液。在又一个方面，本专利技术涉及在用于酶分析之前待稀释(例如用水)的浓缩BGUS酶制剂，例如冻干制剂。因此，在一个实施方式中，本专利技术提供了一种包装的β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶制剂，其包括容器，所述容器包含含有5mg/mlBGUS酶、250mM甜菜碱一水合物、50mML-组氨酸、250mMβ-丙氨酸和250mM蔗糖的冻干制剂；以及在用于酶分析之前，将所述冻干制剂稀释至1mg/mlBGUS酶、50mM甜菜碱一水合物、10mML-组氨酸、50mMβ-丙氨酸和50mM蔗糖的说明书。在又一个方面，本专利技术涉及使用本专利技术的制剂水解葡萄糖醛酸苷连接的方法，例如在生物样品的药物检测中。因此，在一个方面，本专利技术涉及一种水解包含葡萄糖醛酸苷连接的底物的方法，所述方法包括在使得所述葡萄糖醛酸苷连接的水解发生的条件下使所述底物与本专利技术的制剂接触。在一个实施方式中，底物是阿片葡萄糖醛酸苷。本文公开了适合的阿片葡萄糖醛酸苷。在另一个实施方式中，底物是苯并二氮杂葡萄糖醛酸苷。本文公开了适合的苯并二氮杂葡萄糖醛酸苷。在一个实施方式中，底物是在从受试者获得的生物样品中，例如血液、尿液、组织或胎粪。本文进一步详细描述了本专利技术的其他特征和方面。附图说明图1是与野生型大肠杆菌K12序列(SEQIDNO:1)相比，K1S(SEQIDNO:2)、K1T(SEQIDNO:3)、K3(SEQIDNO:4)、K3Δ1(SEQIDNO:5)、K3Δ2(SEQIDNO:6)和K3Δ2S(SEQIDNO:7)突变体的氨基酸序列的比对。突变体中的F385至S396修饰区、G559S或G559T修饰以及C端GLC修饰以粗体和下划线突出显示。具体实施方式本专利技术涉及具有增强的热稳定性以及另外的有利性质的β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶制剂。本专利技术的制剂可以是液体(水性)或冻干(冷冻干燥)的。本专利技术的液体制剂允许甚至在冷冻/解冻循环后保持酶活性。本专利技术的冻干制剂在宽的温度范围(包括高温(例如高于37℃))内保持酶活性。例如，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制剂，其包含β‑葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、两性化合物、L‑组氨酸、β‑丙氨酸和糖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制剂，其包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、两性化合物、L-组氨酸、β-丙氨酸和糖。2.权利要求1所述的制剂，其中所述两性化合物选自甜菜碱一水合物、胆碱盐、甜菜碱盐、6-氨基己酸、5-氨基戊酸和4-氨基丁酸(GABA)。3.权利要求1所述的制剂，其中所述两性化合物是甜菜碱一水合物。4.权利要求3所述的制剂，其中甜菜碱一水合物以至少50mM的浓度存在。5.权利要求4所述的制剂，其中甜菜碱一水合物以50mM-250mM的浓度存在。6.权利要求4所述的制剂，其中甜菜碱一水合物以250mM的浓度存在。7.权利要求1所述的制剂，其中所述糖选自蔗糖、山梨醇、木糖醇、甘油、2-羟丙基-β-环糊精和α-环糊精。8.权利要求7所述的制剂，其中所述糖是蔗糖。9.权利要求8所述的制剂，其中蔗糖以至少50mM的浓度存在。10.权利要求8所述的制剂，其中蔗糖以50mM-500mM的浓度存在。11.权利要求8所述的制剂，其中蔗糖以500mM的浓度存在。12.权利要求1所述的制剂，其中β-丙氨酸以至少50mM的浓度存在。13.权利要求12所述的制剂，其中β-丙氨酸以50mM-250mM的浓度存在。14.权利要求12所述的制剂，其中β-丙氨酸以250mM的浓度存在。15.权利要求1所述的制剂，其中L-组氨酸以至少10mM的浓度存在。16.权利要求12所述的制剂，其中L-组氨酸以10mM-50mM的浓度存在。17.权利要求12所述的制剂，其中L-组氨酸以50mM的浓度存在。18.前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述BGUS酶是重组BGUS酶。19.权利要求18所述的制剂，其中所述重组BGUS酶是突变BGUS酶。20.权利要求19所述的制剂，其中所述突变BGUS酶具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。21.前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述BGUS酶以至少1mg/ml的浓度存在。22.权利要求21所述的制剂，其中所述BGUS酶以1-5mg/ml的浓度存在。23.权利要求21所述的制剂，其中所述BUGS酶以5mg/ml的浓度存在。24.前述权利要求中任一项所述的制剂，...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·A·李，P·N·西塔苏万，M·马里诺瓦，
申请(专利权)人：综合微色谱系统有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US