恒温实时检测罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针制造技术

技术编号:19115677 阅读:265 留言:0更新日期:2018-10-10 02:15
本发明专利技术公开了恒温实时检测罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针,通过设计及实验筛选RPA检测罗非鱼湖病毒的具有特异性的引物和探针,基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧向流动免疫层析技术(LFD)相结合,能在15min内恒温37℃条件下可视化检测罗非鱼湖病毒。

RPA kit for real-time detection of tilapia Lake virus and its specific primers and probes at constant temperature

The invention discloses an RPA reagent kit for real-time detection of Tilapia Lake virus at constant temperature and its special primers and probes. Specific primers and probes for detection of Tilapia Lake virus by RPA are screened through design and experiment. Based on the combination of recombinant enzyme polymerase amplification (RPA) and lateral flow immunochromatography (LFD), the RPA reagent kit can be used within 15 minutes. Visual inspection of tilapia Lake virus at constant temperature of 37 degrees.

【技术实现步骤摘要】
恒温实时检测罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针
本专利技术属于生物
,涉及罗非鱼湖病毒的检测技术,具体涉及恒温实时检测罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针,及在监测罗非鱼湖病毒的应用。
技术介绍
2009年左右以色列的太巴列湖野生罗非鱼和人工饲养罗非鱼同时患上一种不明疾病,死亡率高达70%以上,两三年后厄瓜多尔的人工饲养罗非鱼也相继大量死亡,随后该病原被确诊为罗非鱼湖病毒(TilapiaLakeVirus,“罗湖病毒”),现已在三大洲5个国家得到确认,包括哥伦比亚、厄瓜多尔、埃及、以色列和泰国。2017年6月13日,台湾地区确认首例“罗湖”病毒疫情,罗非鱼出现大量死亡情形,我国已经在海南省发现了TiLV感染。我国是罗非鱼养殖和出口大国,2015年罗非鱼养殖产量达到180万吨,一旦爆发“罗湖”病毒疫情,将导致大批养殖罗非鱼死亡,造成严重的经济损失。TiLV被归类为正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的一种新病毒,电子显微镜显示病毒粒子为具包膜的二十面体结构,大小为55~75nm,为分段、单链的负链RNA病毒,由10个基因片段组成,片段1最大,为1.641KB,片段2~10分别为1.471KB、1.371KB、1.250KB、1.099KB、1.044KB、0.777KB、0.657KB、0.548KB和0.465KB,其中片段1预测蛋白与C型流感病毒的聚合酶基1(polymerasebasic1,PB1)亚基具有弱同源性,其他9个片段与Genbank其他序列无同源性。研究表明,所有片段5′和3′非编码区的核苷酸序列都是相似的,这一结构与流感病毒类似,几乎所有的罗非鱼物种被证明易感TiLV,该病毒主要危害罗非鱼仔稚鱼和幼鱼,对成鱼影响相对较小,因此幼体阶段似乎比成鱼更易感,感染TiLV的患病罗非鱼表现出游动迟缓、食欲不振、体色苍白、皮肤充血糜烂、烂鳃等症状。有证据表明,病鱼的眼、大脑和肝脏中能检测出高浓度的病毒,具体表现为初期眼球突出、晶状体混浊发展为晶状体破裂;软脑膜出血;腹部肿胀、肾脏出血等。TiLV是近年来出现的急性传染性病原。2017年5月,OIE、联合国粮农组织(FAO)等国际组织都针对TiLV发布了公告或预警,要求加强对该病毒的检疫和防范,国外已经在罗非鱼湖病毒的细胞培养、组织病理学、PCR、原位杂交等检测技术方面进行了研究,并建立相应的分子检测方法,而国内针对TiLV的研究几乎空白。TiLV的已有检测技术如LAMP技术反应原理复杂,引物设计繁琐,并且在引物设计时针对靶标序列所需要的保守区段较为严格,反应产物不均一,不利于后期的测序构建克隆。PCR技术耗时较长,成本较高,而且需要精密的温度循环仪器,严重限制PCR技术在现场检测中的应用。
技术实现思路
重组酶聚合酶等温扩增技术(RecombinasePloymeraseAmplication,RPA)利用T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、单链结合蛋白gp32及BsuDNA聚合酶,模拟生物体内DNA复制,在常温下即可对目标片段进行等温扩增,可以在20-40min完成数十亿的DNA拷贝。本专利技术的专利技术人在前期研究的基础上,发现目前还没有用于罗非鱼湖病毒RPA检测的特异性探针及其引物,而合适探针及其引物的设计是运用RPA技术检测罗非鱼湖病毒的最关键步骤,设计并通过实验筛选RPA检测罗非鱼湖病毒的具有特异性的引物和探针,基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和侧向流动免疫层析技术(LFD)相结合,能在15min内恒温37℃条件下可视化检测罗非鱼湖病毒。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现:用于检测罗非鱼湖病毒的RPA专用引物,是根据罗非鱼湖病毒目的基因设计的,且所述罗非鱼湖病毒目的基因序列为:gatgcacctagatcccaagcaatcggctaatataggggagcaagactttgtgagtacccgagaaatttacaagctggatatgttggaactacctcccataagtaggaagggtgatctggacagagctagtggtcttgagacaagatgggacgtcatcttacttctggaatgcctcgactctaca;所述RPA专用引物的正向引物序列为:GATGCACCTAGATCCCAAGCAATCGGCTAA,所述RPA专用引物的反向引物序列为:TGTAGAGTCGAGGCATTCCAGAAGTAAGAT,所述用于侧向流动免疫层析反应的引物序列为:5`Biotin-GATGCACCTAGATCCCAAGCAATCGGCTAA。本专利技术的第二方面,用于检测罗非鱼湖病毒的探针,是根据罗非鱼湖病毒目的基因设计的,且所述罗非鱼湖病毒目的基因序列为:gatgcacctagatcccaagcaatcggctaatataggggagcaagactttgtgagtacccgagaaatttacaagctggatatgttggaactacctcccataagtaggaagggtgatctggacagagctagtggtcttgagacaagatgggacgtcatcttacttctggaatgcctcgactctaca;所述探针的序列为:5`6-FAM-actttgtgagtacccgagaaatttacaagctg/THF/atatgttggaactacctc-3`C3Spacer。本专利技术的第三方面,用于恒温实时检测罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒,包括上述RPA专用引物和探针。优选地,用于恒温实时检测罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒,还包括含有TiLv-7450的阳性对照。优选地,用于恒温实时检测罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒,还包括含有无菌ddH2O的阴性对照。需要进一步说明的是,本专利技术的反应原理在于:采用重组酶聚合酶扩增技术(RPA)与侧向流动免疫层析技术(LFD)相结合,羧基荧光素(FAM)标记的特异探针与生物素标记的核酸扩增产物特异性结合作为抗原,将其滴加于试纸条上便会与胶体金标记抗FAM的抗体结合,形成三元复合物,当扩散到检测线时三元复合物被生物素配体捕获,形成有颜色的检测线。未杂交的FAM标记探针与胶体金标的抗FAM的抗体结合,形成不含生物素的两元复合物,结合在质控线上,从而保证试纸条检测的可靠性。上述方法将侧向流动免疫层析技术作为RPA反应的末端检测,具有检测结果肉眼可判读,操作简单,检测时间短,便于携带等优点。与现有技术相比,本专利技术的积极进步效果在于:(1)本专利技术针对罗非鱼湖病毒目的基因设计具有特异性的RPA专用引物和探针,是运用RPA技术检测罗非鱼湖病毒的关键,克服目前没有罗非鱼湖病毒RPA专用引物和探针的问题。(2)本专利技术中包括上述引物和探针的RPA试剂盒可以快速且成功检测罗非鱼湖病毒TiLV,能在15min内、恒温37℃条件下可视化检测样品是阳性还是阴性。附图说明图1为实施例1中反应产物的试纸条分析结果,其中,1、2号样品为阳性检测结果,NC为阴性样品;图2为实施例2中RPA反应体系特异性引物的筛选,其中,NC为阴性样品;Primer1Primer2和Primer3分别为针对TiLV湖病毒设计的特异性引物。具体实施方式下面结合附图给出本专利技术较佳实施例,以详细说明本专利技术的技术方本文档来自技高网
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恒温实时检测罗非鱼湖病毒的RPA试剂盒及其专用引物和探针

【技术保护点】
1.用于检测罗非鱼湖病毒的RPA专用引物,其特征在于,根据罗非鱼湖病毒目的基因设计的,且所述罗非鱼湖病毒目的基因序列为:gatgcacctagatcccaagcaatcggctaatataggggagcaagactttgtgagtacccgagaaatttacaagctggatatgttggaactacctcccataagtaggaagggtgatctggacagagctagtggtcttgagacaagatgggacgtcatcttacttctggaatgcctcgactctaca,如SEQ ID No 1所示;所述RPA专用引物的正向引物序列为:GATGCACCTAGATCCCAAGCAATCGGCTAA,如SEQ ID No 2所示;所述RPA专用引物的反向引物序列为:TGTAGAGTCGAGGCATTCCAGAAGTAAGAT,如SEQ ID No 3所示;所述用于侧向流动免疫层析反应的引物序列为:5`Biotin‑GATGCACCTAGATCCCAAGCAATCGGCTAA。

【技术特征摘要】
1.用于检测罗非鱼湖病毒的RPA专用引物,其特征在于,根据罗非鱼湖病毒目的基因设计的,且所述罗非鱼湖病毒目的基因序列为:gatgcacctagatcccaagcaatcggctaatataggggagcaagactttgtgagtacccgagaaatttacaagctggatatgttggaactacctcccataagtaggaagggtgatctggacagagctagtggtcttgagacaagatgggacgtcatcttacttctggaatgcctcgactctaca,如SEQIDNo1所示;所述RPA专用引物的正向引物序列为:GATGCACCTAGATCCCAAGCAATCGGCTAA,如SEQIDNo2所示;所述RPA专用引物的反向引物序列为:TGTAGAGTCGAGGCATTCCAGAAGTAAGAT,如SEQIDNo3所示;所述用于侧向流动免疫层析反应的引物序列为:5`Biotin-GATGCACCTAGATCCCAAGCAATCGGCTAA。2.用于检测罗非鱼湖病毒的探针,其特征在于,根据罗非鱼湖病毒目的基...

【专利技术属性】
技术研发人员:王浩汝高盟唐睿哲郭亚男许烨琦
申请(专利权)人:上海海洋大学
类型:发明
国别省市:上海,31

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