一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用，所述方法包括采集待鉴定区域的水样品，过滤处理，采用试剂盒提取DNA，进行real time PCR扩增，并根据溶解曲线的峰值确定鉴定区域是否有长江江豚生存。本发明专利技术所述方法具有效率高、特异性强、相关系数高、线性范围广等优点；本发明专利技术所述方法能够快速、准确鉴定调查水域是否存在长江江豚。

DNA extraction method for Yangtze finless porpoise environment and its application

The invention discloses a method for extracting environmental DNA of Yangtze finless porpoise and its application. The method comprises collecting water samples from the area to be identified, filtering treatment, extracting DNA by kit, real-time PCR amplification, and determining whether the area is alive or not according to the peak value of dissolution curve. The method has the advantages of high efficiency, strong specificity, high correlation coefficient and wide linear range, and the method can quickly and accurately identify the existence of Yangtze finless porpoise in the investigation waters.

【技术实现步骤摘要】
一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种资源调查或种质资源保护的方法，具体为一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用。
技术介绍
长江江豚(Neophocaenaphocaenoidesasiaeorientalis)是一种小型齿鲸，被列为国家二级保护动物，主要分布于长江中下游干流、洞庭湖和鄱阳湖及其主要支流，是一个相对独立的淡水亚种。2006年底开展的长江豚类国际联合考察结果表明,当时其数量约为1800头，且以每年至少5％的速度持续下降，因此采取进一步的举措来保护野生生物是迫在眉睫的。保护长江江豚首先得获得长江江豚在时间和空间上分布的精确数据。传统的物种监测方法通过视觉听觉等方式进行实地调查，耗费大量的人力和物力，而且受天气影响因素较大，很难做到长期监测，因此迫切需要采取一种新的方法来进行长江江豚活动范围及其规律的调查。目前一个从环境中提取DNA并作分析鉴定生物的技术已经成熟，可用于长江江豚资源的调查。环境DNA是指可以直接从有目标生物的环境样本(如土壤、水、空气等)之中直接提取得到的全部DNA。既包括这些活细胞组织的胞内DNA，也包括在环境中死亡，随后因为膜的降解，细胞结构破坏，释放到环境中的胞外DNA；既含有许多不同生物的基因组DNA的混合物，也含有其降解后的DNA片段。环境DNA技术是利用各种分子手段识别从环境样品提取来的eDNA中所包含的信息，从而确定生物在环境中的分布情况。通过对调查水域进行采样、提取环境DNA、分析样本信息，可以来获取长江江豚在调查水域中的信息，进一步完善长江江豚的资源调查。
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种有助于快速、准确鉴定调查水域是否存在长江江豚的方法，本专利技术提供了一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用。技术方案：一种长江江豚环境DNA提取方法，所述方法包括以下步骤：(1)在长江调查水域采集水样，采集设备每次使用前经过漂白粉溶液消毒，无菌水冲洗并干燥；(2)采用孔径为10μm的尼龙材质滤膜抽滤水样，抽滤后折叠滤膜浸没在装有95％乙醇的1.5mLEP管中，-20℃长期保存；(3)将各个水样的滤膜单独提取DNA，提取的DNA置于-20℃冷冻保存；(4)从长江江豚线粒体D-Loop区域设计1对特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，其中：正向引物(SEQIDNO:1)，5’-TATGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTA-3’；反向引物(SEQIDNO:2)，5’-AGATCATTATTTAGCTACCCCCACAAGC-3’)；(5)将长江江豚DNA依次稀释，形成100～10-56个浓度梯度的DNA模板，进行realtimePCR，荧光染料为SYBRGreenI，建立标准曲线，检测所设计引物的特异性；(6)以步骤(3)提取的环境DNA为模板，进行realtimePCR，判断检测样品。优选的，PCR扩增反应的体系为SYBRPremixExTaqⅡ10μL，模板DNA2μL，正反引物各0.8μL，ddH2O6.4μL。优选的，PCR扩增反应的条件为95℃预变性3min；45个循环：95℃变性10s，60℃退火20s；最后72℃3min，4℃保存；溶解曲线，扩增温度以0.2℃的增幅从65℃递增到95℃。优选的，步骤(6)中当扩增曲线Ct值小于40，且溶解曲线为一个尖峰，则检测样品为阳性，即含有长江江豚DNA。以上所述的一种长江江豚环境DNA提取方法在长江江豚的资源调查中的应用。以上所述的一种长江江豚环境DNA提取方法在长江江豚的种质资源保护中的应用。有益效果：(1)本专利技术所述方法具有效率高、特异性强、相关系数高、线性范围广等优点；(2)本专利技术所述方法能够快速、准确鉴定调查水域是否存在长江江豚。附图说明图1是本专利技术所述realtimePCR扩增标准曲线；图2是本专利技术所述realtimePCR扩增曲线；图3是本专利技术所述realtimePCR扩增溶解曲线。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1在长江南通段(32°1′37.21″N，120°26′50.68″E)调查水域，用全新的1L可密封的广口瓶采集水样800mL，设置6个平行样。为防止水样中大颗粒泥沙堵塞滤膜，先用一次性医用纱布过滤水样，过滤后更换纱布。采样设备在每次使用前经过10％漂白粉溶液消毒，无菌水冲洗并干燥。样品冷藏运回实验室，选择孔径为10μm直径的尼龙材质滤膜抽滤水样500mL。抽滤后，折叠滤膜浸没在装有95％乙醇的1.5mLEP管中，-20℃保存。每个水样的滤膜使用E.Z.N.A.TMWaterDNAKit(OMEGAbio-tek,USA)独立提取DNA。将滤膜取出干燥后，提取严格遵照试剂盒说明，90℃水浴溶解难溶细胞，在最后一步加入50μLElutionBuffer来提高提取的eDNA浓度。提取的DNA置于-20℃冷冻保存。从长江江豚线粒体D-Loop区域设计1对特异的引物，正向引物(YFPDLoop)，5’-TATGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTA-3’；反向引物(YFPDLoop)，5’-AGATCATTATTTAGCTACCCCCACAAGC-3’)，进行实时荧光定量PCR扩增。优化realtimePCR扩增反应。扩增反应体系：SYBRPremixExTaqⅡ10μL，模板DNA2μL，正反引物(10μM)各0.8μL，ddH2O6.4μL。扩增反应条件：95℃预变性3min；45个循环包括：95℃变性10s，60℃退火20s；最后72℃3min，4℃保存。溶解曲线，扩增温度以0.2℃的增幅从65℃缓慢递增到95℃，连续测定样品的荧光强度以获取融解曲线。将长江江豚DNA依次稀释，形成6个浓度的(100～10-5)DNA模板，进行realtimePCR，荧光染料为SYBRGreenI，建立标准曲线，标准曲线方程为Y＝-3.409Xlog(X)+39.74，其相关系数为r2＝0.992。扩增标准曲线见图1。以提取的环境DNA为模板，进行realtimePCR。所检测样品Ct值小于40，6个平行样Ct值为24.77±0.34(图2)，而且溶解曲线为一尖峰，Tm值为87.2(图3)，可判断检测样品为阳性，长江南通段(32°1′37.21″N，120°26′50.68″E)区域有长江江豚活动的痕迹。序列表<110>中国水产科学研究院淡水渔业研究中心<120>一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用<160>2<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400&本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长江江豚环境DNA提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)在长江调查水域采集水样，采集设备每次使用前经过漂白粉溶液消毒，无菌水冲洗并干燥；(2)采用孔径为10μm的尼龙材质滤膜抽滤水样，抽滤后折叠滤膜浸没在装有95％乙醇的1.5mL EP管中，‑20℃长期保存；(3)将各个水样的滤膜单独提取DNA，提取的DNA置于‑20℃冷冻保存；(4)从长江江豚线粒体D‑Loop区域设计1对特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，其中：正向引物，5’‑TATGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTA‑3’；反向引物，5’‑AGATCATTATTTAGCTACCCCCACAAGC‑3’；(5)将长江江豚DNA依次稀释，形成100～10‑56个浓度梯度的DNA模板，进行real time PCR，荧光染料为SYBR Green I，建立标准曲线，检测所设计引物的特异性；(6)以步骤(3)提取的环境DNA为模板，进行real time PCR，判断检测样品。

【技术特征摘要】
1.一种长江江豚环境DNA提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)在长江调查水域采集水样，采集设备每次使用前经过漂白粉溶液消毒，无菌水冲洗并干燥；(2)采用孔径为10μm的尼龙材质滤膜抽滤水样，抽滤后折叠滤膜浸没在装有95％乙醇的1.5mLEP管中，-20℃长期保存；(3)将各个水样的滤膜单独提取DNA，提取的DNA置于-20℃冷冻保存；(4)从长江江豚线粒体D-Loop区域设计1对特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，其中：正向引物，5’-TATGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTA-3’；反向引物，5’-AGATCATTATTTAGCTACCCCCACAAGC-3’；(5)将长江江豚DNA依次稀释，形成100～10-56个浓度梯度的DNA模板，进行realtimePCR，荧光染料为SYBRGreenI，建立标准曲线，检测所设计引物的特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐永凯，吴昀晟，俞菊华，徐跑，刘凯，李建林，李红霞，于凡，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32