一种两亲性聚多肽基因载体的制备及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种新型两亲性聚多肽基因载体及其应用，属于纳米医学材料制备技术领域；所述方法包括：以六甲基二硅胺作为引发剂，引发CBZ‑L‑赖氨酸‑NCA和L‑亮氨酸‑NCA两种多肽单体进行NCA开环聚合，最后脱掉CBZ保护基团，得到两亲性嵌段聚多肽基因载体聚（L‑赖氨酸）50‑b‑聚（L‑亮氨酸）15；本发明专利技术的多肽聚合物毒性低，能够压缩质粒DNA组装成规整的纳米颗粒，且转染效率高，是一种有效的基因载体；并且，本发明专利技术的合成方法为可控聚合，且以天然多肽为原料，得到的聚合物安全高效。

Preparation and application of a two affinity polypeptides gene vector

The invention discloses a novel amphiphilic polypeptide gene carrier and its application, belonging to the technical field of nanometer medical material preparation; the method comprises: using hexamethyldisilicone amine as initiator, initiating the NCA ring opening polymerization of two polypeptide monomers CBZ_L_lysine_NCA and L_leucine_NCA, and finally removing the CBZ protective group. The amphiphilic block polypeptide gene carrier poly (L_lysine) 50_b_poly (L_leucine) 15 is obtained; the polypeptide polymer of the invention has low toxicity, can compress plasmid DNA and assemble into regular nanoparticles, and has high transfection efficiency, and is an effective gene carrier; and the synthesis method of the invention is controllable polymerization. The polymers obtained from natural peptides are safe and efficient.

【技术实现步骤摘要】
一种两亲性聚多肽基因载体的制备及其应用
本专利技术涉及一种新型两亲性聚多肽基因载体及其应用，属于纳米医学材料制备

技术介绍
随着对癌症治疗研究的不断深入，核酸已开始成为一类重要的治疗剂。核酸主要包括质粒DNA(pDNA)、小（或短）干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)和寡脱氧核苷酸(ODN)。基因载体转染效率和安全性是人们关注的主要问题。为了提高转染效率，科学家们不断优化阳离子聚合物载体的结构和性质，例如：载体分子量、载体电荷密度、载体的疏水链段、细胞穿透分子能力和靶向治疗。遗憾的是，很少有工作成功地将提高转染效率和降低毒性统一起来。因此，制备安全高效的基因载体是非常重要而且必要的。阳离子聚合物中的疏水结构部分能够促进基因传递，是因为疏水基团能够压缩DNA并且与细胞表面的疏水脂质层发生相互作用。选择生物相容性较好并且能够可控聚合的多肽作为基因载体的原因在于：第一，多肽是可用作传递基因的生物可降解材料，广泛应用于基因传递、药物输送以及病毒载体的治疗；第二，多肽聚合物可以通过α-氨基酸-N-羧酸酐（NCA）开环可控聚合生成。为了合成两亲性多肽聚合物，必须采用可控聚合方法，这样才能得到可控聚合物。到目前为止，发展起来了许多可控聚合方法，例如原子转移自由基聚合（ATRP）和可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)。但不管是ATRP还是RAFT，产物结构中的C-C键是非常牢固的，不容易断裂，那么这样的载体进入到体内是很难降解的。而对于基因载体而言，材料的生物可降解性质是非常重要的。多肽聚合物是一类生物可降解材料，作为基因载体是安全的。
技术实现思路
为了克服以上不足，本专利技术的目的是提供一种两亲性聚多肽基因载体，基因载体的分子组成为聚（L-赖氨酸）50-b-聚（L-亮氨酸）15；基因载体为亲水段L-赖氨酸与疏水段L-亮氨酸组成的两亲性嵌段共聚物；本专利技术的两亲性聚多肽基因载体能够压缩质粒DNA并组装成粒径小于100nm的颗粒，并将其输送至细胞内，该基因载体转染效率高，且低毒。本专利技术还提供一种两亲性聚多肽基因载体的制备方法，包括以下步骤：（1）将六甲基二硅胺(HMDS)溶解于干燥的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，快速加入受N-苄氧羰基（CBZ）保护的N-苄氧羰基-α-L-氨基酸-N-羧酸酐（CBZ-L-赖氨酸-NCA）单体，进行第一次反应，再加入L-亮氨酸-NCA单体，进行第二次反应，得到受CBZ保护的聚(CBZ-L-赖氨酸)50-b-聚（L-亮氨酸)15嵌段共聚物；（2）将聚(CBZ-L-赖氨酸)50-b-聚（L-亮氨酸)15溶解在三氟乙酸中，加入含33%溴化氢的冰醋酸溶液，搅拌反应，再用无水乙醚沉淀，得到两亲性嵌段共聚产物聚(L-赖氨酸)50-b-聚(L-亮氨酸)15，即为两亲性聚多肽基因载体。优选的，步骤（1）中，所述的六甲基二硅胺与的用量与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为0.05:100。优选的，步骤（1）中，所述的六甲基二硅胺、CBZ-L-赖氨酸-NCA和L-亮氨酸-NCA摩尔比为1：50：15，两亲性嵌段共聚产物聚(L-赖氨酸)50-b-聚(L-亮氨酸)15共聚物中聚（L-赖氨酸）和聚（L-亮氨酸）两部分摩尔比为50：15，CBZ-L-赖氨酸-NCA和L-亮氨酸-NCA的转化率均为100%。优选的，步骤（1）中，所述的第一次反应与第二次反应条件相同，反应条件为：温度20~30℃，时间72~96h，反应在氮气保护下无水操作。优选的，步骤（2）中，所述的聚(CBZ-L-赖氨酸)50-b-聚（L-亮氨酸)15的用量与三氟乙酸用量的质量体积比为1.0g：30mL；聚(CBZ-L-赖氨酸)50-b-聚(L-亮氨酸)15与含33%溴化氢的冰醋酸溶液的摩尔比1:8；聚(CBZ-L-赖氨酸)50-b-聚(L-亮氨酸)15与无水乙醚的质量体积比为1.0g：150mL。优选的，步骤（1）中，所述的CBZ-L-赖氨酸-NCA单体的制备方法包括：将N-苄氧羰基赖氨酸和三光气溶解于干燥的四氢呋喃中，N-苄氧羰基赖氨酸、三光气和四氢呋喃的用量比为5.0g：5.0g：100mL；50℃下反应至溶液清澈透明，再将溶液蒸馏浓缩得到浓缩液，用干燥的正己烷沉淀得到CBZ-L-赖氨酸-NCA粗产物，然后将粗产物溶于四氢呋喃中，再用干燥的正己烷重结晶，重复三次后，得到纯净的CBZ-L-赖氨酸-NCA单体；其中，浓缩液与四氢呋喃以及干燥正己烷的体积比为5：3：24。优选的，步骤（1）中，所述L-亮氨酸-NCA单体的制备方法包括：将L-亮氨酸和三光气溶解于干燥四氢呋喃中，L-亮氨酸、三光气和四氢呋喃的用量比为5.0g：6.0g：100mL；在N2保护下于50℃搅拌反应6h，用干燥的正己烷沉淀得到L-亮氨酸-NCA粗产物，再将粗产物溶于四氢呋喃和正己烷的混合液中，四氢呋喃与正己烷的体积比为1：8。重结晶，重复三次后得到L-亮氨酸-NCA单体。优选的，干燥四氢呋喃的方法为：将CaH2和四氢呋喃加入到一个干净的圆底烧瓶中，CaH2和四氢呋喃的质量体积比为1.0g：500mL，搅拌24h后蒸馏得到干燥的四氢呋喃。优选的，干燥正己烷的方法为：将CaH2和正己烷加入到一个干净的圆底烧瓶中，CaH2和正己烷的质量体积比为1.0g：500mL，搅拌24h后蒸馏得到干燥的正己烷。优选的，干燥DMF的方法为：将体积比为5：1的DMF和甲苯混合，在150℃和N2保护下发生共沸，冷却到室温时，就可得到干燥的DMF。本专利技术所制备的一种两亲性聚多肽基因载体的应用是压缩质粒DNA组装为纳米颗粒并将其传送至细胞内。有益效果（1）本专利技术与现有技术相比，安全且毒性低，过程可控，通过控制第二嵌段亮氨酸的投料量，得到含有特定比例亲水疏水链段的两亲性嵌段共聚物，原料转化率为100%。（2）本专利技术中共聚物的第一段聚(CBZ-L-赖氨酸)50设计成聚合度为50（理论分子量为13.1×103g/mol）的链段，实际所测的分子量是13.2×103g/mol，这与理论值是非常接近的，说明聚合可控。从第一链段开始，加入是第一单体量15/50摩尔比的L-亮氨酸-NCA单体，以合成不同长度的第二链段，得到了嵌段聚合物：聚(CBZ-L-赖氨酸)50-b-聚（L-亮氨酸)15，其理论分子量是14.7×103g/mol，与实测值一样，证明聚合可控。（3）本专利技术的两亲性聚多肽基因载体具有压缩质粒DNA的能力，能够压缩质粒DNA并组装形成纳米颗粒，其粒径分布均一，不超过100nm。（4）本专利技术的两亲性聚多肽基因载体的细胞转染效率高，与PEI（聚乙烯亚胺）相当（PEI通常作为基因转染的黄金标准被用来参照）；其细胞毒性低，安全无害。附图说明图1为实施例1制备的CBZ-L-赖氨酸-NCA单体的核磁共振氢谱图；图2为实施例1制备的L-亮氨酸-NCA单体的核磁共振氢谱图；图3为实施例1制备的聚(CBZ-L-赖氨酸)50-b-聚（L-亮氨酸)15的核磁共振氢谱图；图4为实施例1制备的聚(L-赖氨酸)50-b-聚（L-亮氨酸)15的核磁共振氢谱图；图5为实施例1制备的聚(L-赖氨酸)50-b-聚（L-亮氨酸)15压缩质粒DNA的透射电镜图；图6为实施例1制备的聚(L-赖氨酸)50-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种两亲性聚多肽基因载体，其特征在于，所述基因载体分子组成为聚（L‑赖氨酸）50‑b‑聚（L‑亮氨酸）15；所述基因载体是由亲水段L‑赖氨酸与疏水段L‑亮氨酸组成的两亲性嵌段共聚物。

【技术特征摘要】
1.一种两亲性聚多肽基因载体，其特征在于，所述基因载体分子组成为聚（L-赖氨酸）50-b-聚（L-亮氨酸）15；所述基因载体是由亲水段L-赖氨酸与疏水段L-亮氨酸组成的两亲性嵌段共聚物。2.一种两亲性聚多肽基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将六甲基二硅胺溶解于干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，加入CBZ-L-赖氨酸-NCA单体，进行第一次反应，再加入L-亮氨酸-NCA单体，进行第二次反应，得到受CBZ保护的聚(CBZ-L-赖氨酸)50-b-聚（L-亮氨酸)15嵌段共聚物；（2）将聚(CBZ-L-赖氨酸)50-b-聚（L-亮氨酸)15溶解在三氟乙酸中，加入含33%溴化氢的冰醋酸溶液，搅拌反应，再用无水乙醚沉淀，得到两亲性嵌段共聚产物聚(L-赖氨酸)50-b-聚(L-亮氨酸)15，即为两亲性聚多肽基因载体。3.根据权利要求2所述的一种两亲性聚多肽基因载体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的六甲基二硅胺与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为0.05:100。4.根据权利要求2所述的一种制备两亲性聚多肽基因载体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的六甲基二硅胺、CBZ-L-赖氨酸-NCA和L-亮氨酸-NCA摩尔比为1：50：15；所述的两亲性嵌段共聚产物...

【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，周志平，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32