唾液酸寡糖-铂纳米粒子、制备方法及其在流感病毒免疫检测方面的用途技术

本发明专利技术涉及一种唾液酸寡糖‑铂纳米粒子、制备方法及其在对流感病毒进行免疫检测方面的用途。所述唾液酸寡糖‑铂纳米粒子为在铂纳米粒子的表面通过S‑Pt共价键连接有带有连接臂的唾液酸寡糖。本发明专利技术的免疫检测方法完全避免了抗体和酶的使用，具有高稳定性、易于制备和获取等优点。

Sialic oligosaccharide platinum nanoparticle, preparation method and its application in influenza virus immunoassay

The invention relates to a sialic acid oligosaccharide platinum nanoparticle, a preparation method and the application in the immunoassay of influenza virus. The sialic acid oligosaccharide platinum nanoparticle is a sialic acid oligosaccharide with a connecting arm connected by a covalent S_Pt bond on the surface of the platinum nanoparticle. The immunoassay method of the invention completely avoids the use of antibodies and enzymes, and has the advantages of high stability, easy preparation and acquisition.

【技术实现步骤摘要】
唾液酸寡糖-铂纳米粒子、制备方法及其在流感病毒免疫检测方面的用途
本专利技术涉及一种唾液酸寡糖-铂纳米粒子及其制备方法，以及该唾液酸寡糖-铂纳米粒子在对流感病毒进行免疫检测方面的用途。
技术介绍
流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的人畜共患传染病，它的宿主涉及人、猪、鸟、马和海豚等多种动物。研究证实，流感病毒表面的糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)能够特异识别宿主细胞表面的糖链受体，这是流感病毒感染宿主、进而复制并继续传播的生物学基础。对多种宿主而言，某些流感病毒变体具有高致病性和/或高死亡率，严重威胁动物和人类的健康。因此，本领域存在对流感病毒进行快速准确的检测的需求。随着生物技术的发展，酶被广泛应用于包括生化反应、生物识别在内的各种生物化学实验中。其中，辣根过氧化物酶(HorseradishPeroXIdase，HRP)具有催化过氧化氢氧化发色底物(即，发生显色反应)的活性，且在一定范围内颜色深浅与酶的浓度线性相关。因此，通常利用辣根过氧化物酶来标记抗体，实施多种免疫检测。常用于流感病毒检测的夹心酶联免疫吸附测定(SandwichEnzymeLinkedImmunosorbentAssay，SandwichELISA)即可利用辣根过氧化物酶标记的二抗进行最后的显色。在该方法中，先由捕获抗体将流感病毒固定，再通过酶标记的抗体进行显色，实现定性和定量测量。作为改进，本领域通过对抗体进行优化，或采用竞争ELISA、DotELISA等方法提高测量的稳定性或降低样品中其它成分造成的假阳性。然而，上述方法均依赖于抗体和/或酶的使用。抗体和酶均为蛋白，其获取和优化相对复杂，且这些反应的灵敏度和结果稳定性极大依赖于反应温度和pH。此外，这些方法操作繁琐，对操作人员的技术和熟练程度要求较高，费时费力。近年来发展的纳米技术为生物检测提供了新的可能。已经发现包括金纳米材料、铂纳米材料、磁性纳米材料和量子点等在内的各种新材料各自具有独特的理化性质。其中，铂纳米粒子因具有极高的催化活性被广泛应用于汽车尾气处理、电化学和癌症治疗等领域。最近的研究发现，铂纳米粒子具有类似于辣根过氧化物酶的活性，可利用铂纳米粒子来标记抗体，替代ELISA中的辣根过氧化物酶。然而，该检测中铂纳米粒子仍需借助蛋白抗体与靶分子结合，难以解决实验条件要求比较苛刻和结果稳定性较差的问题。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供了一种唾液酸寡糖-铂纳米粒子，其中，在铂纳米粒子的表面通过S-Pt共价键连接有式XI所示的化合物以及式X-1或X-2所示的化合物：式X-1：式X-2：式XI：HO(CH2CH2O)m(CO)n(CH2)k(CH)pSR；其中，所述式X-1、式X-2和式XI中，所述x为1-3的整数，所述m为0-6的整数，所述n为0-1的整数，所述k为0-11的整数，所述p为0或2，所述R为S或H；所述Ac为乙酰基，所述R1为羟基或乙酰胺基，所述R2为氢或L-岩藻糖，所述R3为氢或硫酸酯(硫酸与糖环上的羟基成酯，SO3H)，所述R4为羟基或乙酰胺基。在第二方面，本专利技术提供了制备如第一方面所述的唾液酸寡糖-铂纳米粒子的方法，所述方法包括：将式X-1或式X-2所示化合物以及式XI所示化合物与含有铂纳米粒子的溶液混合，获得所述唾液酸寡糖-铂纳米粒子。在第三方面，本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种独立包装的第一方面所述的唾液酸寡糖-铂纳米粒子，以及辣根过氧化物酶显色底物。在第四方面，本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含独立包装的A试剂、B试剂、C试剂以及辣根过氧化物酶显色底物；其中，所述A试剂包含独立包装的式X-1和/或式X-2所示化合物，所述B试剂包含式XI所示化合物，所述C试剂为含有铂纳米粒子的溶液。在第五方面，本专利技术提供第一方面所述的唾液酸寡糖-铂纳米粒子以及第三方面或第四方面所述的试剂盒在对流感病毒进行免疫检测方面的用途。在第六方面，本专利技术提供了一种对样品中的流感病毒进行检测的方法，所述方法包括如下步骤：a)提供固相表面；b)使所述样品与所述固相表面相接触，从而将流感病毒固定至所述固相表面，得到待测固相表面；c)向步骤b)的所述待测固相表面添加第一方面所述的唾液酸寡糖-铂纳米粒子，或者添加第四方面所述试剂盒中的试剂A、试剂B和试剂C，得到测定混合物；d)对步骤c)的所述测定混合物进行洗涤，去除未结合的物质，从而得到洗涤后的混合物；以及e)向步骤d)的所述洗涤后的混合物中加入辣根过氧化物酶显色底物，进行检测。附图说明图1为根据本专利技术的一个实施方式，利用本专利技术的方法(左)与利用夹心ELISA方法(右)检测流感病毒原理的比较。图2为本专利技术实施例3制备的唾液酸寡糖-铂纳米粒子的结构示意图。在所示出的结构中，唾液酸寡糖具有如式X-2所示的结构，其中，x为1，m为6，n为0，k为11，p为0，R、R2和R3为H，R1和R4为OH。图3为实施例2制备的铂纳米粒子的电镜照片。图4为实施例2制备的铂纳米粒子的XRD表征。图5为实施例3制备的唾液酸寡糖-铂纳米粒子3’SLl-PtNPs与相应的带有连接臂的唾液酸寡糖的NMR表征。图6为根据实验例1，利用3’SLl-PtNP和6’SLl-PtNP检测Ca04H1N1流感病毒的结果图。Lac-Pt为作为对照的乳糖-铂纳米粒子的结果。图7为根据实验例2，利用3’SLl-PtNP和6’SLl-PtNP检测VieH5N1流感病毒的结果图。Lac-Pt为作为对照的乳糖-铂纳米粒子的结果。图8为根据实验例3，利用3’SLl-PtNP和6’SLl-PtNP检测ShaH7N9流感病毒结果图。Lac-Pt为作为对照的乳糖-铂纳米粒子的结果。具体实施方式本专利技术通过连接臂将流感病毒受体(唾液酸寡糖)连接到铂纳米粒子上，获得了同时具有流感病毒宿主特异性识别性能和化学-光检测信号转换性能的唾液酸寡糖-铂纳米粒子。其中，使用特定的唾液酸寡糖使得不仅能够检测流感病毒(包括A型和B型流感病毒)是否存在，还能够区分所检测的流感病毒的受体特异性，甚至可以通过构建和分析不同唾液酸寡糖与不同流感病毒毒株之间相互作用强弱的指纹图谱确定病毒的亚型。另一方面，利用铂纳米粒子的辣根过氧化物酶性质，取代传统夹心ELISA检测中的捕获抗体、一抗和二抗，简化了ELISA的操作步骤，降低了实验成本，提高了结果的稳定性。本专利技术的方法完全避免了抗体和酶的使用，具有高稳定性、易于制备和获取等优点。此外，本领域之前未报道过构建带有功能化糖基的铂纳米颗粒，本专利技术的方法为铂纳米粒子提供了新的应用前景。在第一方面，本专利技术提供了一种唾液酸寡糖-铂纳米粒子，其中，在铂纳米粒子的表面通过S-Pt共价键连接有式XI所示的化合物以及式X-1或X-2所示的化合物：式X-1：式X-2：式XI：HO(CH2CH2O)m(CO)n(CH2)k(CH)pSR；其中，所述式X-1、式X-2和式XI中，所述x为1-3的整数，所述m为0-6的整数，所述n为0-1的整数，所述k为0-11的整数，所述p为0或2，所述R为S或H；所述Ac为乙酰基，所述R1为羟基或乙酰胺基，所述R2为氢或L-岩藻糖，所述R3为氢或硫酸酯(硫酸与糖环上的羟基成酯，SO3H)，所述R4为羟基或乙酰胺基。优选地，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种唾液酸寡糖‑铂纳米粒子，其中，在铂纳米粒子的表面通过S‑Pt共价键连接有式XI所示的化合物以及式X‑1或X‑2所示的化合物：式X‑1：

【技术特征摘要】
1.一种唾液酸寡糖-铂纳米粒子，其中，在铂纳米粒子的表面通过S-Pt共价键连接有式XI所示的化合物以及式X-1或X-2所示的化合物：式X-1：式X-2：式XI：HO(CH2CH2O)m(CO)n(CH2)k(CH)pSR；其中，所述式X-1、式X-2和式XI中，所述x为1-3的整数，所述m为0-6的整数，所述n为0-1的整数，所述k为0-11的整数，所述p为0或2，所述R为S或H；所述Ac为乙酰基，所述R1为羟基或乙酰胺基，所述R2为氢或L-岩藻糖，所述R3为氢或硫酸酯，所述R4为羟基或乙酰胺基。2.制备如权利要求1所述的唾液酸寡糖-铂纳米粒子的方法，所述方法包括：将式X-1或式X-2所示化合物以及式XI所示化合物与含有铂纳米粒子的溶液混合，获得所述唾液酸寡糖-铂纳米粒子。3.一种试剂盒，所述试剂盒包含独立包装的一种或多种如权利要求1所述的唾液酸寡糖-铂纳米粒子，以及辣根过氧化物酶显色底物。4.一种试剂盒，所述试剂盒包含独立包装的A试剂、B试剂、C试剂以及辣根过氧化物酶显色底物；其中，所述A试剂包含独立包装的式X-1和/或式X-2所示化合物，所述B试剂包含式XI所示化合物，所述C试剂为含有铂纳米粒子的溶液，其中，所述式X-1、式X-2和式XI具有如下的结构：式X-1：式X-2：式XI：H...

【专利技术属性】
技术研发人员：李学兵，郑隆堂，张振兴，吕迅，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11