一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法技术

本发明专利技术涉及医疗制剂技术领域，具体涉及一种负载BMSCs的胶原‑柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法。该负载BMSCs的胶原‑柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法包括：步骤一、胶原蛋白溶液的制备；步骤二、柞蚕丝素蛋白溶液的制备；步骤三、BMSCs悬液的制备；步骤四、复合支架的制备。本发明专利技术所制得的负载BMSCs的胶原‑柞蚕丝素蛋白复合支架具有良好的生物相容性，无炎症反应、毒性反应、免疫排斥反应等，细胞黏附力强，可促进皮肤创面修复。同时该复合支架能保持创面的湿度，防止体液与水分的流失；可提供生物屏障，防止创面感染、细菌侵入；并且具备一定的柔韧性和拉伸性能，在组织愈合期间保持其功能和形态。

Preparation method of collagen tussah silk fibroin composite scaffold loaded with BMSCs

The invention relates to the technical field of medical preparations, in particular to a preparation method of collagen-tussah silk fibroin composite scaffold loaded with BMSCs. The preparation method of the collagen/tussah silk fibroin composite scaffold loaded with BMSCs includes: step 1, preparation of collagen solution; step 2, preparation of tussah silk fibroin solution; step 3, preparation of BMSCs suspension; step 4, preparation of composite scaffold. The collagen-tussah silk fibroin composite scaffold loaded with BMSCs prepared by the invention has good biocompatibility, no inflammatory reaction, toxic reaction, immune rejection reaction, strong cell adhesion, and can promote skin wound repair. At the same time, the composite scaffold can maintain the wound humidity, prevent the loss of body fluid and water, provide a biological barrier, prevent wound infection, bacterial invasion, and has certain flexibility and tensile properties, maintain its function and morphology during tissue healing.

【技术实现步骤摘要】
一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法
本专利技术涉及医疗制剂
，具体涉及一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法。
技术介绍
干细胞研究进展，尤其是间充质干细胞的研究进展为创伤修复提供了新的思路和策略。近些年研究表明，骨髓间充质干细胞(BMSCs)在皮肤微环境下可分化表皮细胞、真皮细胞、血管内皮细胞及皮肤附属器细胞等，为组织工程化皮肤提供了新的种子细胞来源，而且基础及临床研究提示间充质干细胞促进皮肤修复及作为皮肤替代物主要取决于其分泌的活性物质。如低氧条件培养的人羊水间充质干细胞培养液可通过TGF-beta/SMAD2和PI3K/Akt信号通路促进皮肤伤口愈合。此外，研究证实间充质干细胞可分泌抗纤维化的细胞因子和生长因子、免疫调节与抗炎、分泌一氧化氮、抑制血管内皮细胞的EMT及肌成纤维细胞的分化，促进缺血性组织的血管再生，抑制皮肤过度纤维化，为损伤的组织提供一个再生的微环境，提高创面愈合质量，是创面修复治疗的新策略。目前创面修复治疗常用的生物医用材料主要包括丝素蛋白、胶原蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸等。胶原蛋白是一种天然的高分子蛋白质，在人体内含量丰富，主要分布于动物的骨、肌腱、韧带、皮肤和角膜等组织中。以胶原蛋白为原料的支架有利于细胞黏附并对细胞起支持保护作用，且有利于外源细胞的导入。但胶原蛋白支架具有降解速度快、新生组织塑形欠佳、机械应力强度低等不足，目前常与其他材料复合使用。丝素蛋白具有良好的保湿吸湿性，可以防止体液和水分的流失，使创面保持一定的湿度，是一种常用生物材料。研究发现，丝素蛋白材料不影响胚胎间充质干细胞的生长特性、表面标志和多向分化潜能，具有良好的生物相容性。柞蚕丝素除具备家蚕丝素在生物医药领域的优点外，它还含有大量精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)三肽重复序列，可作为细胞受体，与细胞表面的整合素配体发生特异性相互作用，促进细胞与受体的粘附。柞蚕丝素蛋白的良好生物相容性和对细胞的特异性亲和性，为细胞组织工程等领域提供一类高性能、低成本、具有我国特色的生物活性材料。然而，现有技术中用于创面修复治疗的生物医用材料存在分化的能力不好的缺陷，因此，亟需对现有技术进行改进。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法，该制备方法所制得的负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架具有良好生物相容性，能提高诱导剂诱导分化的能力，进而促进创面愈合的优点。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：提供一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法，它包括以下步骤：步骤一、胶原蛋白溶液的制备：对富含胶原蛋白的动物组织进行提取胶原蛋白，得到粗提取液，然后将粗提取液进行纯化处理，得到纯胶原蛋白溶液；步骤二、柞蚕丝素蛋白溶液的制备：将柞蚕丝进行脱胶处理，再将处理后的柞蚕丝放入溶解液中加热溶解，得到柞蚕丝素蛋白粗提取液，然后将柞蚕丝素蛋白粗提取液进行过滤、透析处理，制得柞蚕丝素蛋白溶液；步骤三、BMSCs悬液的制备：用DMEM培养基反复冲洗来源于动物的骨髓腔，得到骨髓组织冲洗液，随后将骨髓组织冲洗液进行离心，然后弃去上清液后在培养液中重悬细胞，接种，然后置于培养箱中进行原代培养，一定时间后进行首次全量换液，保留贴壁细胞，之后隔一定时间换液，当保留的贴壁细胞达到一定百分比融合时，用胰酶消化，并进行离心后按一定比例进行细胞传代培养，然后选取BMSCs，进行消化和离心后，用培养基重悬，得到BMSCs悬液；步骤四、复合支架的制备：将步骤一制得的纯胶原蛋白溶液与步骤二制得的柞蚕丝素蛋白溶液分别用水稀释至一定的浓度，然后按比例进行混合，将混合液冷冻干燥，制得胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架，然后将制得的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架进行消毒，再将步骤三得到的BMSCs悬液在胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架中培养一定时间，即制得所述负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架。上述技术方案中，所述步骤一中，对富含胶原蛋白的动物组织进行提取胶原蛋白的方法为酸法、碱法、盐法或酶法中的一种或任意两种相结合；所述步骤一中，所述纯化处理包括依次进行的离心、盐析和超滤处理。上述技术方案中，所述步骤二中，所述脱胶处理为将柞蚕丝投入碱溶液中煮沸脱胶30min～50min，然后用水洗涤，并重复脱胶两次。上述技术方案中，所述步骤二中，所述溶解液为硝酸钙乙醇溶液，其中，所述硝酸钙乙醇溶液中硝酸钙的摩尔浓度为8mol/L～10mol/L；所述步骤二中，所述加热溶解的温度为50℃～60℃。上述技术方案中，所述步骤三中，用DMEM培养基反复冲洗来源于动物的骨髓腔，得到骨髓组织冲洗液，随后将骨髓组织冲洗液进行离心，然后弃去上清液后在培养液中重悬细胞，接种，然后置于培养箱中进行原代培养，45h～50h后进行首次全量换液，保留贴壁细胞，之后隔天换液，当保留的贴壁细胞达到80％～90％融合时，用质量浓度为0.2％～0.3％的胰酶消化，并进行离心后按1:2的比例进行细胞传代培养，然后选取第3～8代BMSCs，进行消化和离心后，用培养基重悬，得到BMSCs悬液。上述技术方案中，所述步骤三中，所述接种为加入4mL～6mL含质量浓度为10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，然后轻轻吹打混匀后接种于细胞培养瓶内。上述技术方案中，所述步骤三中，所述细胞传代培养的条件为置于37℃、5％CO2培养箱中培养。上述技术方案中，所述步骤三中，所述BMSCs为鼠骨髓间充质干细胞、猪骨髓间充质干细胞或羊骨髓间充质干细胞中的任一种。上述技术方案中，所述步骤四中，将步骤一制得的纯胶原蛋白溶液与步骤二制得的柞蚕丝素蛋白溶液分别用水稀释至浓度为5mg/mL～10mg/mL；然后按所述胶原蛋白溶液与所述柞蚕丝素蛋白溶液的混合质量比为1～5:1的比例混合。上述技术方案中，所述步骤四中，然后将制得的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架在紫外线下进行消毒20h～30h，再将步骤三得到的BMSCs悬液在胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架中培养70h～75h，即制得所述负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架。本专利技术与现有技术相比较，有益效果在于：(1)本专利技术提供的一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法，所制得的负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架是以胶原蛋白与柞蚕丝素蛋白作为生物材料制成复合支架系统，为BMSCs提供合适的载体，模拟机体皮肤组织的结构与功能，有利于创面修复的新型复合支架。(2)本专利技术提供的一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法，所制得的负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架能保持创面的湿度，防止体液与水分的流失；并可提供生物屏障，防止创面感染、细菌侵入；并且具备一定的柔韧性和拉伸性能，在组织愈合期间保持其功能和形态。(3)本专利技术提供的一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法，所制得的负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架，其负载的BMSCs能向骨和脂肪这两个胚层分化，具有分化能力好的优点，且胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架能够提高诱导剂诱导分化的能力，进而促进创面愈合的优点。(4)本专利技术提供的一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种负载BMSCs的胶原‑柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤一、胶原蛋白溶液的制备：对富含胶原蛋白的动物组织进行提取胶原蛋白，得到粗提取液，然后将粗提取液进行纯化处理，得到纯胶原蛋白溶液；步骤二、柞蚕丝素蛋白溶液的制备：将柞蚕丝进行脱胶处理，再将处理后的柞蚕丝放入溶解液中加热溶解，得到柞蚕丝素蛋白粗提取液，然后将柞蚕丝素蛋白粗提取液进行过滤、透析处理，制得柞蚕丝素蛋白溶液；步骤三、BMSCs悬液的制备：用DMEM培养基反复冲洗来源于动物的骨髓腔，得到骨髓组织冲洗液，随后将骨髓组织冲洗液进行离心，然后弃去上清液后在培养液中重悬细胞，接种，然后置于培养箱中进行原代培养，一定时间后进行首次全量换液，保留贴壁细胞，之后隔一定时间换液，当保留的贴壁细胞达到一定百分比融合时，用胰酶消化，并进行离心后按一定比例进行细胞传代培养，然后选取BMSCs，进行消化和离心后，用培养基重悬，得到BMSCs悬液；步骤四、复合支架的制备：将步骤一制得的纯胶原蛋白溶液与步骤二制得的柞蚕丝素蛋白溶液分别用水稀释至一定的浓度，然后按比例进行混合，将混合液冷冻干燥，制得胶原‑柞蚕丝素蛋白复合支架，然后将制得的胶原‑柞蚕丝素蛋白复合支架进行消毒，再将步骤三得到的BMSCs悬液在胶原‑柞蚕丝素蛋白复合支架中培养一定时间，即制得所述负载BMSCs的胶原‑柞蚕丝素蛋白复合支架。...

【技术特征摘要】
1.一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤一、胶原蛋白溶液的制备：对富含胶原蛋白的动物组织进行提取胶原蛋白，得到粗提取液，然后将粗提取液进行纯化处理，得到纯胶原蛋白溶液；步骤二、柞蚕丝素蛋白溶液的制备：将柞蚕丝进行脱胶处理，再将处理后的柞蚕丝放入溶解液中加热溶解，得到柞蚕丝素蛋白粗提取液，然后将柞蚕丝素蛋白粗提取液进行过滤、透析处理，制得柞蚕丝素蛋白溶液；步骤三、BMSCs悬液的制备：用DMEM培养基反复冲洗来源于动物的骨髓腔，得到骨髓组织冲洗液，随后将骨髓组织冲洗液进行离心，然后弃去上清液后在培养液中重悬细胞，接种，然后置于培养箱中进行原代培养，一定时间后进行首次全量换液，保留贴壁细胞，之后隔一定时间换液，当保留的贴壁细胞达到一定百分比融合时，用胰酶消化，并进行离心后按一定比例进行细胞传代培养，然后选取BMSCs，进行消化和离心后，用培养基重悬，得到BMSCs悬液；步骤四、复合支架的制备：将步骤一制得的纯胶原蛋白溶液与步骤二制得的柞蚕丝素蛋白溶液分别用水稀释至一定的浓度，然后按比例进行混合，将混合液冷冻干燥，制得胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架，然后将制得的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架进行消毒，再将步骤三得到的BMSCs悬液在胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架中培养一定时间，即制得所述负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架。2.根据权利要求1所述的一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，对富含胶原蛋白的动物组织进行提取胶原蛋白的方法为酸法、碱法、盐法或酶法中的一种或任意两种相结合；所述步骤一中，所述纯化处理包括依次进行的离心、盐析和超滤处理。3.根据权利要求1所述的一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，所述脱胶处理为将柞蚕丝投入碱溶液中煮沸脱胶30min～50min，然后用水洗涤，并重复脱胶两次。4.根据权利要求1所述的一种负载BMSCs的胶原-柞蚕丝素蛋白复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，所述溶解液为硝酸钙乙醇溶液，其中，所述硝酸钙乙醇溶液中硝酸钙的摩尔浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：周艳芳，彭新生，崔碧玲，刘雯恩，范志强，李玉玲，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44