靶向还原敏感共载化疗药物与P-gp耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法技术方案

本发明专利技术涉及一种靶向还原敏感共载化疗药物与P‑gp耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法。采用具有还原敏感性两亲性共聚物PCL7500‑ss‑PEG7500‑ss‑PCL7500构建具有还原敏感性的聚合物囊泡，通过分子间疏水作用力包载疏水性药物紫杉醇和Tariquidar，并采用pH梯度法在其亲水内腔载入阿霉素，叶酸靶向基团通过共价键修饰于囊泡表面，从而构建了具有靶向、还原响应、化疗协同作用的聚合物囊泡。小分子P糖蛋白（P‑gp）抑制剂Tariquidar通过阻断P‑gp对底物的外排作用来减少耐药细胞的药物抵抗，增加了耐药细胞对药物的摄取，从而逆转多药耐药。本发明专利技术的纳米递送载体能够同时包载疏水性化疗药物和亲水性化疗药物，具有肿瘤靶向且对肿瘤微环境具有还原响应性，可实现逆转肿瘤的多药耐药杀伤肿瘤。

Preparation of targeted delivery system of reduced sensitivity co loading chemotherapy drugs and P-gp resistance reversal agents

The invention relates to a preparation method of a Nanodelivery system for targeting reduction sensitive Co-loading chemotherapeutic drugs and P_gp resistance reversal agent. Reduction-sensitive polymeric vesicles were constructed by amphiphilic copolymer PCL7500 SS PEG7500 SS PCL7500. Hydrophobic drugs paclitaxel and Tariquidar were loaded into the hydrophilic cavity by intermolecular hydrophobic interaction. Adriamycin was loaded into the hydrophilic cavity by pH gradient method, and the folic acid-targeted groups were repaired by covalent bonding. Polymer vesicles with synergistic effects of targeting, reduction response and chemotherapy were constructed on the surface of vesicles. Tariquidar, a small molecule P glycoprotein (P_gp) inhibitor, reduces drug resistance of drug-resistant cells by blocking the efflux of P_gp to substrate and increases drug uptake by drug-resistant cells, thereby reversing multidrug resistance. The nano-delivery carrier of the invention can simultaneously contain hydrophobic and hydrophilic chemotherapeutic drugs, has tumor targeting and reductive responsiveness to tumor microenvironment, and can reverse tumor multidrug resistance to kill tumor.

【技术实现步骤摘要】
靶向还原敏感共载化疗药物与P-gp耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法
本专利技术涉及一种靶向还原敏感共载化疗药物与P-gp耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法，具体是靶向还原敏感共载化疗药物与P-gp耐药逆转剂的聚合物囊泡的纳米递送系统的制备方法。本专利技术的纳米递送载体能够同时包载疏水性化疗药物和亲水性化疗药物，具有肿瘤靶向且对肿瘤微环境具有还原响应性，可实现逆转肿瘤的多药耐药并通过不同化疗药物的协同作用杀伤肿瘤。
技术介绍
化疗是目前临床上治疗肿瘤的最主要的手段，由于大多数抗肿瘤药物水溶性差、不良反应较大和选择性差，严重地制约着抗肿瘤药物在临床上的应用。此外，癌症治疗中出现的一大难题是患者肿瘤组织对药物形成的耐药性。肿瘤细胞多药耐药（Multidrugresistance，MDR）是导致化疗失败、限制治愈率和降低肿瘤患者生存率的主要原因之一。因此开发合适的药物载体，将具有不同作用机制的药物同时递送到同一肿瘤细胞内，再联合MDR逆转剂克服药物被肿瘤细胞泵出，可以实现提高药效、降低毒副作用并克服肿瘤多药耐药性。从递药系统角度克服肿瘤MDR也是众多制剂研究者的研究热点之一。与传统的化疗药物相比，纳米载药体系能够有效降低药物毒性、提高药物稳定性、改善药物分布。聚合物囊泡作为纳米制剂的一种，展现出许多优势：能同时包载疏水和亲水药物；可以利用肿瘤的EPR效应有效地将药物运输到病理区域；理想的聚合物囊泡通过胞吞作用能够消耗细胞的ATP，从而减弱P-gp的外排作用；同时通过设计肿瘤微环境响应的聚合物囊泡，能够实现药物在肿瘤靶部位的快速释放而提高疗效。本专利技术研究者尝试用两亲性聚合物制备具有还原响应性聚合物囊泡，同时包载疏水和亲水性化疗药物，再联合P-gp抑制剂及叶酸靶向，促进药物蓄积、增加药物生物利用度。此外，由于多药耐药细胞存在多种耐药机制，不能形成细胞内有效药物浓度，而载药纳米粒由于自身独特的尺寸效应和表面效应能够提高肿瘤组织药物浓度，达到多药耐药逆转作用。随着纳米技术研究的深入，有理由相信其会对肿瘤的治疗产生深远的影响。P糖蛋白（P-gp/ABCB1）作为ATP结合盒式蛋白(ATP-bindingcassettetransporter，ABC）超家族最早发现的一员，在介导药物的转运中发挥着重要的作用，直接影响了药物的生物利用度。大量事实表明P-gp的存在使得耐药肿瘤细胞对抗肿瘤药物不敏感，不少学者研究了针对P-gp靶点的药物来克服肿瘤MDR。主要有1）应用P-gp调节剂或抑制剂来调节P-gp的外排作用；2）通过纳米载体包裹P-gp底物来逃避P-gp的识别作用；3）将纳米制剂与P-gp调节剂或抑制剂联合给药来发挥更好的作用。本研究采用Tariquidar为P-gp抑制剂联合纳米制剂来克服肿瘤耐药。Tariquidar作为第三代P-gp抑制剂，其各方面性能相对于第一、二代P-gp抑制剂都有所改进。而且P-gp抑制剂的应用能显著提高化疗药物的生物利用度，有效增强对肿瘤的杀伤力，可作为一个很有潜力的治疗方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种靶向还原敏感共载化疗药物与P-gp耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法，具体是靶向还原敏感共载化疗药物与P-gp耐药逆转剂的聚合物囊泡的纳米递送系统的制备方法。本专利技术的纳米递送载体能够同时包载疏水性化疗药物和亲水性化疗药物，具有肿瘤靶向且对肿瘤微环境具有还原响应性，可实现逆转肿瘤的多药耐药并通过化疗药物的协同作用杀伤肿瘤。本专利技术提供的靶向还原敏感共载化疗药物与P-gp耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法包括的步骤：1）将两亲性共聚物PCL-ss-PEG-ss-PCL（25mg）、0.2%-5%(wt)DSPE-PEG(2000)Folate（二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸）、4%-5%(wt)TQR与2.5mgPTX充分溶于二氯甲烷或甲醇与二氯甲烷（体积比为1:1）的混合有机溶剂中，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，使之在反应器内壁形成一层均匀的薄膜，真空干燥12-20小时；2）配制150-300mM硫酸铵水溶液，样品膜分散于5ml硫酸铵溶液中，60-65℃下水化5h。混匀，放置至室温，冰浴下超声30min（5mm探头，Ampl30%），得到稳定、均匀的载药还原敏感聚合物囊泡分散液；3）将聚合物囊泡悬液置于处理好的透析袋（MWCO：8000-14000）中后，在蔗糖溶液(102.69g蔗糖+1.152g组氨酸溶于1L水中)透析20h；4）DOX载入：将5.0mgDOX加入到上述透析后的样品中，60-65℃恒温磁力搅拌下(300r/min)，孵育1-2h。5）去除未包载药物：用pH7.4PBS透析20h后4℃保存，得到靶向肿瘤的共载化疗药物与P-gp抑制剂的还原响应聚合物囊泡分散液；所述PCL-ss-PEG-ss-PCL共聚物分子量为12000-24000，其中PEG亲水链段质量百分数为20-40%。所述用于水化的硫酸铵水溶液的体积（mL）与载体材料质量（mg）比在1:4-1:20之间均可以形成均匀的聚合物囊泡分散液，且硫酸铵水溶液介于150-300mM都可以形成均匀的聚合物囊泡分散液。所述用于透析的pH7.4PBS可以是生理盐水。所述亲水性化疗药物为阿霉素，也可以是柔红霉素、阿柔比星、表阿霉素、伊达比星或米托蒽醌。所述疏水性化疗药物为紫杉醇，也可以是多西紫杉醇、长春地辛、长春瑞宾长春碱类。所述P-gp抑制剂是Tariquidar，也可以是Elacridar、Zosuquidar和Laniquidar第三代P-gp抑制剂。上述方法制备的靶向还原敏感共载化疗药物与P-gp耐药逆转剂的纳米递送系统在制备治疗肿瘤药物中的应用。所述的治疗肿瘤药物为靶向还原敏感共载化疗药物和P-gp逆转剂的聚合物囊泡纳米粒。该药物递送系统是由具有还原敏感特性的PCL-ss-PEG-ss-PCL聚合物构建。其中，疏水性药物紫杉醇（PTX）和Tariquidar（TQR）包载于聚合物囊泡的疏水性膜层，叶酸靶向基团通过共价键修饰于囊泡表面，应用pH梯度法在其亲水内腔载入阿霉素（DOX）。所制备的囊泡外壳为亲水性PEG，具有长循环和空间稳定特性，还原响应使其能靶向肿瘤后快速释药，并且Tariquidar的载入有效克服了肿瘤细胞的多药耐药。本专利技术所述的靶向肿瘤的共负载化疗药物与P-gp抑制剂的还原响应型纳米递送系统可特别应用于抗乳腺癌MCF-7/ADR耐药细胞、人肝癌细胞HepG2/ADR和人卵巢癌紫杉醇耐药株A2780/Taxol等高表达P-gp的肿瘤耐药细胞。总之，本专利技术具有实质性的特点：1）本专利技术所用的载体材料具有良好的生物相容性、生物可降解性。能自组装形成粒径小、分散度好稳定的聚合物囊泡。2）本专利技术所设计的聚合物囊泡能够同时包载亲水性和疏水性药物，克服了游离阿霉素的体内不稳定性和易被体内清除以及疏水性药物难溶性带来的生物利用度低的缺点。3）聚合物囊泡由具有二硫键的还原敏感性材料制成，到达肿瘤局部后，能通过对肿瘤微环境响应而快速释放药物，从而提高治疗效果并降低毒副作用。4）聚合物囊泡表面的亲水层PEG具有柔性，使得聚合物胶束其具备了长循环特性和空间稳定性，延长了其在血液中的循环时间。5）聚合物囊泡合适的尺寸大小得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向还原敏感共载化疗药物与P‑gp耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法，其特征在于包括的步骤：1）将两亲性共聚物PCL‑ss‑PEG‑ss‑PCL、0.2%‑5% (wt) DSPE‑PEG (2000) Folate、4%‑5% (wt) P‑gp耐药逆转剂与疏水性化疗药物充分溶于二氯甲烷或甲醇与二氯甲烷（体积比为1:1）的混合有机溶剂中，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，使之在反应器内壁形成一层均匀的薄膜，真空干燥12‑20小时；2）上述薄膜样品分散于5 mL的 150‑300 mM硫酸铵溶液中，60‑65℃下水化 5 h；混匀，放置至室温，冰浴下超声30 min，得到稳定、均匀的载药还原敏感聚合物囊泡分散液；3）将聚合物囊泡悬液置于处理好的截留分子量为MWCO8000‑14000 Da的透析袋中，在蔗糖溶液中透析20 h，其中，该蔗糖溶液为102.69 g 蔗糖+1.152 g组氨酸溶于 1 L 水；4）亲水性化疗药物载入：将5.0 mg 阿霉素加入到上述透析后的样品中，60‑65℃恒温磁力搅拌下300 r/min，孵育1‑2 h；5）去除未包载药物：用pH7.4 PBS 透析 20 h后4℃保存，得到靶向肿瘤的共载化疗药物与P‑gp抑制剂的还原响应聚合物囊泡分散液。...

【技术特征摘要】
1.一种靶向还原敏感共载化疗药物与P-gp耐药逆转剂的纳米递送系统的制备方法，其特征在于包括的步骤：1）将两亲性共聚物PCL-ss-PEG-ss-PCL、0.2%-5%(wt)DSPE-PEG(2000)Folate、4%-5%(wt)P-gp耐药逆转剂与疏水性化疗药物充分溶于二氯甲烷或甲醇与二氯甲烷（体积比为1:1）的混合有机溶剂中，用旋转蒸发仪除去有机溶剂，使之在反应器内壁形成一层均匀的薄膜，真空干燥12-20小时；2）上述薄膜样品分散于5mL的150-300mM硫酸铵溶液中，60-65℃下水化5h；混匀，放置至室温，冰浴下超声30min，得到稳定、均匀的载药还原敏感聚合物囊泡分散液；3）将聚合物囊泡悬液置于处理好的截留分子量为MWCO8000-14000Da的透析袋中，在蔗糖溶液中透析20h，其中，该蔗糖溶液为102.69g蔗糖+1.152g组氨酸溶于1L水；4）亲水性化疗药物载入：将5.0mg阿霉素加入到上述透析后的样品中，60-65℃恒温磁力搅拌下300r/min，孵育1-2h；5）去除未包载药物：用pH7.4PBS透析20h后4℃保存，得到靶向肿瘤的共载化疗药物与P-gp抑制剂的还原响应聚合物囊泡分散液。2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述PCL-ss-PEG-ss-PCL共聚物分子量为12000-24000，其中PEG亲水链段质量百分数为20-40%。3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述用于水化的硫酸铵水溶液的体积与载体材料质量比在1:4-1:20，且硫酸铵水溶液介于150-300mM。4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述用于透析的pH7.4PBS是生理盐水。5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述亲水性化疗药物盐酸阿霉素，用柔红霉素、阿霉素、阿柔比星、表阿霉素、伊达比星或米托蒽醌亲水性化疗药物替换。6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琳华，朱敦皖，秦玉，樊帆，张志明，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12